Evrimsel Mühendislik Yöntemi İle Rhodobacter Sphaeroides’in Cocl 2 Stresine Dirençli Suşlarının Eldesi

Abstract

Rhodobacter sphaeroides metabolik çeşitliliğe sahip bir gram negatif α- proteobakteridir. Bu bakteri değişik şartlar altında kullanıldığında karbon kaynağına bağlı olarak fotoheterotrofik, kemoheterotrofik, fototrofik, kemoototrofik ve fermentatif olarak üreyebilmektedir. Havadaki serbest azotu bağlayarak organik azot ihtiyacını karşılar. Kükürtü elektron alıcı olarak kullanacak metabolik aktiviteye sahip değilken hidrojeni indirgeyici güç olarak kullanabilmektedir. Bu özelliğinden dolayı R. sphaeroides organik hidrojen üretiminde kullanılmaktadır. Fotosentetik metabolizması O 2 varlığına bağlı olarak düzenlenir. Kısmi O 2 basıncının düşük olduğu şartlarda R. sphaeroides hücre membranında invajinasyon oluşturarak fotosentez için gerekli olan kromatoforların biyosentezi için ortam sağlar. Fotosentezde rol alan genlerin regülasyonundan üç sistem sorumludur: PrrBA - 2 alt birimli aktivasyon sistemi, PpsR – baskılayıcı sistem ve FnrL anaerobik regulatörü. cbb3 sitokrom c oksidaz ve koenzim Q havuzu, oksijen varlığında oksijen seviyelerini ölçerek oluşturdukları sinyalleri PrrBA sistemine ve PpSR baskılayıcısına yönlendirir. FnrL anaerobik enerji üretiminden sorumlu olan genleri aktive ederek aerobik üremeden anaerobik üremeye geçişi sağlar. Prp (fotosentetik cevap düzenleyici) sistemi iki bileşenden oluşur: membranda yer alan kinaz yapısındaki PrrB sensörü ve onun tamamlayıcısı olan cevap düzenleyici PrrA. Bu sistem anaerobik şartlar altında fotosentetik genleri aktifleştirir. PrrBA sistemi CO2, N2 ve H2 kullanımında görev alan genlerin regülasyonundan sorumludur. Aerobik şartlarda, şiddetli ışık altında fotosentetik gen grubunda yer alan PsSR redoks proteini baskılayıcı olarak rol alır. R. sphaeroides 2 dairesel kromozom ve 5 endojen plazmid içermektedir. Kromozomlar sırası ile 3.188.631 ve 943.022 baz çifti büyüklüğündedir. Plazmidlerin 4 tanesi yaklaşık 4 kb iken, en küçük olan 42 kb dir. Kromozom 1; 3106, kromozom 2; 874 açık okuma çerçevesi içerir. Bu organizmanın genomu çok sayıda DNA dizi kopyaları içermektedir. Bu dizi kopyalarının R. sphaeroides’in geniş spektrumlu metabolik aktivitesinden büyük ölçüde sorumlu olduğu düşünülmektedir. R. sphaeroides lateral uzantılı bir kamçıya sahiptir. Bu kamçı genelde saat yönünde olacak şekilde tek bir şekilde dönebilmektedir. Anaerobik koşullar altında bakterinin rotasyonunu yüzme sırasında duraksayarak sağladığı belirlenmiştir. Oryantasyonunu durduğu anlarda sağlar ve yüzerken hızı sürekli olarak değişkenlik gösterir. Ortalama yüzme hızı 35 μm/s dir. Fotosentetik üreme sırasında R. sphaeroides intrasitoplazmik bir membran sistemi sentezler. Membran sistemi fotosentezin birinci kısmı için gerekli olan bütün bileşenleri içerir. Bu bileşenler B875α, B875β ve B800-850α ve B800-850β 3 ışık toplayıcı kompleksten oluşur. Bu kompleksler ışık enerjisinin absorbe edilip enerjinin reaksiyon merkezine iletilmesinden sorumludur. CO2 fiksasyonu için Kalvin döngüsü kullanılır. Kalvin döngüsünde yer alan iki enzim bu döngüde spesifiktir: xxifosforibulokinaz ve ribuloz-1,5-bisfosfat karboksilaz/oksigenaz. Reaksiyon merkezi kompleksi H, M ve L olmak üzere 3 altbirimden oluşur. L ve M altbirimleri integral membran proteinleridir. Işık toplayıcısı (LH) ve reaksiyon merkezi (RC) pigment proteinlerinin kodlanmasında rol alan genler 2 farklı operonda yer almaktadır. LH1, RC-L ve RC-M polipeptidleri puf operonundaki genler tarafından kodlanırken, LH2 puc operonunda yer alan genler tarafından kodlanır. Her ne kadar ışık yoğunluğu bu genlerin regülasyonunda öenmli bir rol alsa da asıl kontrol edici faktör oksijen yoğunluğudur. R. sphaeroides aerobik ortamlarda, oksijeni elektron alıcı olarak kullanarak kemotrofik olarak büyüyebilen fakültatif anaerob bir organizmadır. Oksijen seviyesinin eşik değeri altına düşmesi durumunda fotosentetik pigmentler ve pigment bağlayıcı proteinlerin sentezi tetiklenir. R. sphaeroides; hidrojen gazı, polihidroksibutirat, B 12 vitamini, koenzim Q10, 5-aminolevulinik ve porfirin üretiminde kullanılan, endüstriyel ve tıbbi alanda önemli yere sahip bir organizmadır. Farklı stres koşullarında izlediği stratejiler nedeni ile biyoremediasyon uygulamalarında kullanılır. Ağır metal stresine maruz kaldığında, membran yapısında bulunan yağ asidi miktarını değiştirerek membranını sağlamlaştırma yoluna gider. Co 2+ gibi divalent katyonları dış membranına bağlayabilmesi ağır metal direncine katkı sağlayan stratejilerden biridir. R. sphaeroides’in bu geniş metabolik repertuarı direnç metabolizmalarının anlaşılması açısından bilim çevresinde büyük bir araştırma alanı oluşturmuştur. Nevrit ve anemi tedavisinde kullanılan B 12 vitamininin sentezi R. sphaeroides tarafından aerobik ve anaerobik olarak sağlanır. R. sphaeroides P47 suşu karanlık aerobik şartlar altında 75 μg/g kuru ağırlığında B 12 vitamini sentezleme kapasitesine sahip iken aynı suş, aydınlık anaerobik şartlar altında 87 μg/g kuru ağırlığında B 12 vitamini sentezleyebilmektedir. Serbest radikallerin nötralizasyonunda kullanılan koenzim Q10 antioksidanı R. sphaeroides tarafından aydınlık anaerobik koşullar altında, karanlık ve aerobik koşullar altında sentezleyebildiğinin 2 katı kadar sentezlenir. Tetrapirol biyosentezinde ara ürün olarak sentezlenen 5-aminolevulik ait (ALA) R. sphaeroides tarafından levulinik asit kullanılarak sentezlenir. Bu çalışmada endüstriyel ve tıbbi alanda bu kadar geniş bir kullanım alanına sahip olan R. sphaeroides’in Co 2+ ağır metaline karşı olan direncinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Yüksek kobalt konsantrasyonlarını tolere eden suş, evrimsel mühendislik yöntemi ile elde edilmiştir. Evrimsel mühendislik yaklaşımı bakterinin artan kobalt konsantrasyonlarında üretilmesini gerektirdiğinden ilk adım olarak seleksiyon sürecinin başlangıç stres konsantrasyonu belirlenmiştir. Evrimsel mühendislik yaklaşımı, çalışılan organizmanın metabolizması hakkında geniş bilgi sahibi olunmasını gerektirmez. Başlangıç konsantrasyonu, referans R. sphaeroides R- 26’ nın 11 farklı kobalt konsantrasyonunda büyütülerek taranması ile bulundu. Tarama sonuçlarına göre popülasyonların eldesi 0,1 mM kobalt konsantrasyonu içeren besiyeri ortamında başlatıldı. Kobalt konsantrasyonu 0,1 mM’ dan 15 mM’a kademeli olarak arttırılarak 64 nesil elde edildi. Sağkalım yüzdeleri her 24 saatte bir kontrol ve stres kültürlerinin OD 535 değerleri ölçülerek hesaplandı. OD 535 ölçümleri yapılırken, diğer yandan kültürler LB katı besi yerlerine ekilerek kontaminasyon kontrolü yapıldı. Katı besi yerlerinde üretilen hücreler morfolojik olarak analiz edildi. Karotenoid üretme yeteneğine sahip ve karakteristik kırmızı renk veren hücrelerin varlığı, kontaminasyon olmadığının göstergesi olarak kullanıldı. Sağkalım yüzdesi 0.2 değerine düştüğünde popülasyon eldesi sonlandırıldı. Son popülasyon olarak 64. nesil belirlendi. xxiiPopülasyonun eldesinin ardından 64. nesil ve referans kültürüne ait hücrelerin gelişme eğrileri, kobalt içeren ve içermeyen olmak üzere iki farklı ortamda elde edildi. Ortamda kobaltın olmadığı durumlarda referans kültürü ve 64. nesil benzer üreme özelliği göstermiştir. Diğer yandan 4 mM kobalt içeren besiyeri ortamlarında üretilen kültürlerden elde edilen gelişme eğrileri önemli oranda farklılık göstermiştir. 64. nesile ait hücrelerin 4 mM kobalt konsantrasyonu varlığında gösterdikleri üreme stressiz besi ortamında gösterdikleri üreme ile benzerlik gösterirken, referans kültüründeki hücrelerin üremesinin önemli ölçüde inhibe edildiği gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar, 64. neslin kobalt stres direncinin geliştirilebildiğinin göstergesidir.

Rhodobacter sphaeroides is a metabolically diverse organism which is able to fix molecular nitrogen and produce H 2 as side product. It can grow under both oxic and anoxic conditions heterotrophically or photosynthetically. This wide repertoire of metabolism puts this organism in the centre of metabolic regulation and bioremediation studies. R. sphaeroides is used in the production of vitamin B 12 , coenzyme Q10, 5-aminolevulinic acid (ALA), porphyrin, as well as in bioremediation of heavy metals. R. sphaeroides follows different metabolic strategies when exposed to different stress factors. It is able to regulate its photosynthetic machinery sensing O 2 tensions. When partial O 2 pressure is reduced, R. sphaeroides develops invagination in its cellular membrane. Biosynthesis of chromatophores, which are crucial for photosynthesis, takes place in these invaginations. There are three systems involved in regulation of photosynthetic genes: the PrrBA two subunit activation system, the PpsR repressor and the FnrL, anaerobic regulator. The genes are regulated mainly by O 2 levels. R. sphaeroides has two chromosomes and five naturally occurring plasmids. Many of its genes are duplicated between the two chromosomes. These gene duplications generate the genetic diversity which allows the bacteria widen its spectrum of metabolic capabilities. Chromosome I contains 3106 open reading frames whereas chromosome 2 contains 874. It possesses a flagellum similar to that of E. coli which is able to rotate only in clockwise direction. When exposed to heavy metal stress, R. sphaeroides alters fatty acid composition to increase its membrane integrity. The accumulation of heavy metals in the environments imposes new strategies for restoring the original site conditions. Bioremediation, providing high specificity and versatility has received a great attention in this area. In this study, R. sphaeroides was used to obtain a cobalt-resistant strain. Evolutionary engineering approach of metabolic engineering was used to increase the cobalt tolerance of the bacterium, by growing it under gradually increasing stress conditions. This approach being a ‘bottom-up’ approach does not require extensive information about the metabolism of the organism. The R. sphaeroides strain R-26 was used in this study. Initial cobalt concentration to be used for selection was determined after screening analysis of the reference strain at 11 different cobalt concentrations. According to the screening results, the selection of the populations was started with 0.1 mM cobalt concentration. Cobalt concentrations were increased gradually from 0.1 mM to 15 mM through 64 generations. Survival rates were monitored every 24 hours by measuring OD 535 values of control and stress cultures. At the same time points, cultures were spread on LB plates to confirm that no contamination has occurred. Cultures which were grown on solid medium were examined morphologically. Cultures that produced carotenoids were identified by their characteristic red colour. When the survival rate decreased to 0.2, the selection process was terminated for further analysis. Growth behaviour of the reference strain and the last population obtained by evolutionary engineering were xixcompared in media with and without cobalt. The cultures showed similar growth characteristics when there was no cobalt in the medium. However, there was a significant difference, when cultures were grown in a medium containing 4 mM cobalt. The 64 th population cells were able to maintain their growth rate nearly the same when exposed to 4 mM cobalt, while the reference strain’s growth was inhibited. These results indicate the improved resistance of 64 th population towards cobalt.