Meme Kanserli Hastalardan Alınan Sağlıklı Ve Tümörlü Dokularda Anti-apoptotik Bag-1 Proteinin Rolünün Çalışılması

Abstract

Meme kanseri dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Gelişmiş ülkelerde bile halen kanserden ölümlere neden olan en önemli kanser tiplerinden birisidir. Meme kanserinin özellikle kadınlarda görülme sıklığının artması ve tedaviye yönelik yeni yaklaşımlara olan ihtiyaç artmakta ve bu alandaki araştırmalar hız kazanmaktadır. Meme kanseri alt tipleri anatomik gruplandırmanın yanında moleküler profillerine göre de sınıflandırılmaktadır. Kanser hücreleri normal hücrelerden farklı olarak hücre membranlarında, sitozollerinde ve çekirdeklerinde farklı oranlarda reseptörler bulundururlar. Sinyal yolaklarında görevli hormon ve benzeri moleküller bu reseptörlere bağlanarak hücrede değişimlere sebep olur. Meme kanseri hücreleri de bulundurdukları üç önemli reseptöre göre moleküler olarak sınıflandırılabilir. Bu reseptörler: östrojen reseptörü (ER), progesteron reseptörü (PR) ve HER2 (human epidermal growth factor receptor 2)'dur. Bu reseptörlerin pozitifliği hücre içindeki yüksek düzeyde ifadelerini göstermekte ve histopatolojik olarak belirlenebilmektedir. Bu reseptörlere göre sınıflandırılan alt tipler hastalığın tanısında ve tedavisinde önemli rol oynamaktadır. Ayrıca, halihazırda bu hedeflere yönelik kullanılan ilaçlar, özellikle üçlü negatiflik (triple-negative) gösteren hastalarda, ilacın etki mekanizmasına bağlı olarak direnç geliştirebilmekte ve hastalıktan kurtulma oranını düşürmektedir. Bu yüzden, hücre sağ kalımı ve tümörün ilerlemesi ile alakalı yolakların ve dolayısıyla yeni ilaç hedeflrinin aydınlatılması gerekmektedir. Bu amaçla bir çok çalışma yeni bir hedef olarak Bag-1 ve ilgili hücre sağ kalımı yolaklarına odaklanmaktadır. Bag (Bcl-2 asosiye athano gen) protein ailesi birçok organizma arasında evrimsel olarak süregelmiştir. Bu ailenin üyeleri hücrede gerçekleşen süreçleri pozitif veya negatif yönde kontrol ederek veya normal ve stres koşulları altında diğer proteinlerle kompleksler oluşturarak homestazinin korunmasını sağlar. Bag-1 ise bu ailenin çok fonksiyonlu anti-apoptotik olma özelliğine sahip en önemli üyesidir. Bu proteinin, tek mRNA'dan alternatif translasyonla üretilen değişik izoformları vardır. Bu izoformlar, belirli hedef molekülleriyle etkileşerek karsinogenez, farklılaşma, motilite, çoğalma, hücre sağ kalımı, apoptoz ve transkripsiyon gibi hücredeki birçok süreci regüle ederek kritik rol oynarlar. Bag-1 izoformlarından S formu sitozolde, L formu nükleer lokalizasyon sinyali sayesinde nükleusta, M ise her ikisinde bulunma özelliğine sahiptir. Bulundukları yerlerde, sinyal yolaklarındaki kinazlar: Raf, Akt ve benzeri proteinler başta olmak üzere nükleer hormon reseptörleri ile de etkileşimleri bilinmektedir. xxiv Bag-1'ın C-Raf veya Bcl-2 ile etkileşimi hücrenin kaderini belirleyen ana mekanizmalardandır. Bag-1 proteininin, kanser gelişimini C-Raf fosforilasyonu ile aktive eden MAP kinaz yolağının önemli bir üyesi olan Raf-1 (C-Raf) ile etkileştiği çalışmalarla gösterilmştir. Raf ailesinin diğer bir üyesi B-Raf ile de etkileştiği ve özellikle stres koşulları altında C-Raf/B-Raf ile dönüşümlü ve birlikte etkileşerek hücre sağ kalımı yolağında önemli rol oynadığı bilinmektedir. Ayrıca, Bag-1S izoformunun sitozolde lokalize olduğu ve hücrede anti-apoptotik bir etkiye sahip olduğu da kanıtlanmıştır. Bundan başka, Akt yolağı da hücre sağ kalımı mekanizmalarında PI3K yolağında önemli aktör olarak kendini göstermektedir. Akt hücre içerisinde bir çok sinyal molekülü tarafından aktive edilse de özellikle yapısal olarak aktif olan HER2 reseptörü Akt'ın aşırı aktivasyonuna neden olmaktadır. Fosforillenmiş Akt proteininin aşırı aktiflenmesiyle, Bad'ın Serine 136 konumundan fosforilasyonu aşırı tetiklenmekte ve fosforillenmiş Bad'ın Bcl-XL etkileşiminin bozulması sonucu apoptotik yolak inhibe olmaktadır. Laboratuvarımızda daha önce MCF-7 (tümörijenik), MDA-MB-231 (tümörijenik) ve MCF-10A (tümörijenik olmayan) epitel hücre hatlarıyla yapılan hücre kültürü çalışmalarında, Bag-1'ın ve etkileşim partnerlerinin hücre sağ kalımı ve apoptotik yolaklarda önemli rol oynadığı gösterilmiştir. Bu doğrultuda, özellikle ilaç direnci gelişmesi meme kanserli hastalarda sağ kalım oranını düşürdüğünden, yeni bir hedef olarak Bag-1 belki de bu ilaca cevapsızlık mekanizmalarında önemli bir noktada yer alıyor olabilir. Bu çalışmada ise, Bag-1'ın hücre sağ kalımındaki rolünü meme kanserli hastalardan alınan taze normal ve tümörlü doku örnekleriyle karşılaştırmalı olarak araştırmak için, Bag-1 proteininin B-Raf, C-Raf, Akt etkileşim partnerleri, ekspresyon seviyeleri ve fosforilasyon durumları immün blotlama ve immünçökeltme yöntemleriyle gerçekleştirilmiştir. Bunun yanında, Bad fosforilasyonu ve 14-3-3 seviyeleri de göz önüne alınarak araştırılmıştır. Sonuç olarak, elde edilen deneysel sonuçlara göre, aynı hastadan alınan kanserli ve normal doku örnekleri karşılaştırıldığında genellikle Bag1 izoformlarında artış gözlenmiştir. Bunun dışında, hormon pozitif, üçlü-negatif, üçlüpozitif ve diğer tip dokularda B-Raf, C-Raf ve Akt ifade ve fosforilasyon seviyeleri incelenerek ER, PR ve HER2 durumlarına göre Bag-1 ile olan ilişkisi değerlendirilmiştir. Ser136 fosforilasyonu bulunan Bad, tümör örneklerinde dramatik bir şekilde artmasıyla birlikte Bag-1 ekspresyonunun yanında Akt, C-Raf ve B-Raf ifadesi ve fosforilasyonlarında önemli bir artış gözlemlenmiştir. Öte yandan, 14-3-3 seviyesi istatistiksel olarak önemli olmasa da tüm hastalar göz önüne alındığında normalden tümöre artış Bad fosforilasyonuyla korelasyon göstermektedir. Bag-1 immünçökeltme deneyleri sonucunda yapılan blotlama analizleriyle, interaksiyon partnerleri olan C-Raf, B-Raf and Akt proteinlerinin fosforile formları araştırılmış, normal ve tümör örnekleri arasındaki farklar gösterilmiştir. Sonuç olarak, tümörleşme durumunda Bag-1/Raf/Akt kompleksinin oluşabileceği meme kanseri olgularında gösterilmiştir. Ayrıca, immunohistokimya sonuçları da tümörlü dokularda özellikle sitozolde p-C-Raf ve p-B-Raf yüksek ifadesi ve lokalizasyonunu, p-Bad (Ser136)'ın ise hem sitoplazmik hem de nükleer yoğunluğunu kanıtlamaktadır. Meme kanseri olgularındaki ER, PR and HER2 reseptörlerinin aşırı ifadesine bağlı olarak, bu bulgular Bag-1'ın hücre sağ kalım ve ölüm eksenindeki rolünün altını çizmektedir. Bu doğrultuda, Bag-1'in PI3K/Akt ve MAPK yolakları arasındaki iletişimini bu yolaklardaki önemli partnerlerle etkileşerek kontrol ettiği kanısına varılmıştır. Geniş çerçevede bakıldığında, bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, meme kanserindeki hücre sağ kalım mekanizmalarının aydınlatılmasına ve yeni ilaç hedeflerine odaklanarak, yeni terapötik yaklaşımların ortaya çıkmasına katkıda bulunacaktır.

Breast cancer is a significant health problem all over the world. In developed countries, it maintains one of the most prevalent causes of cancer death. Due to its high occurence rate among women, breast cancer is a popular field of interest for investigation and treatment. In addition to anatomic subtypes of breast cancer, these cells are grouped according to their molecular profiles. Cancer cells have receptors on their cell membrane and in their cytosol and nucleus which are different from normal cells. Signaling messengers, such as hormones, bind to these receptors, and lead to changes in the cell. Breast cancer cells could be classified by three important receptors including estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). Overexpression of these receptors represents their overexpression in a cell and it can be histopathologically evaluated. Subgroups of breast cancer types affect the diagnosis and prognosis of disease. Besides, the efficiacy of currently used drugs varies between types. Especially in triple-negative patients, drug resistance is very common and consequently the survival rate is lower. Therefore, all these issues require the clarification of new drug targets and pathways in cell survival and tumor progression. In order to reveal new drug targets, researchers focus on Bag-1 related cell survival pathways. Bag (Bcl-2-associated athanogene) protein family is evolutionally maintained among most organisms. The members of this family control homeostasis in cell by regulating molecular processes in a positive and negative manner by forming complexes with other proteins under normal and stress conditions. Bag-1 is a significant member of this family which is a multi-functional anti-apoptotic protein and it has different alternatively translated isoforms from a single mRNA. These isoforms have many critical roles in the cell through interactions with target molecules to regulate carcinogenesis, differentiation, motility, proliferation, cell survival, apoptosis and transcription. Bag-1S isoform is located in cytosol, Bag-1L is found in nucleus due to its nuclear localization signal and Bag-1M is found in both locations. These isoforms interact with kinases such as Raf and Akt in signaling pathways, in addition to nuclear hormone receptors. It has been shown that Bag-1 interacts with Raf-1 (C-Raf) which is a member of MAP kinase pathway that is important in cancer. Once C-Raf is fully activated, it triggers most of the downstream proteins like Bad and 14-3-3 to promote histone phosphorylation and oncogenic transcription. Also, it is known that Bag-1S isoform localizes in cytosol and has an anti-apoptotic effect in a cell. Bag-1 interactions with C-Raf, B-Raf, Akt, Hsp70 and/or Bcl-2 are main mechanisms that determine cell fate. Akt is another vital player in cell survival mechanisms, mainly in association with PI3K pathway. It could be activated by different cell signaling molecules in a cell but especially the signal from the constitutively active HER2 receptor leads to its overactivation. It is also known that phosphorylated Akt gets activated and triggers the Bad phosphorylation at site S136, and leads to inhibition of apoptosis. In our previous studies, it has been shown that Bag-1 and its interaction partners have critical roles in cell survival and apoptosis pathways in MCF-7 (tumorigenic), triplenegative MDA-MB-231 (tumorigenic) and MCF-10A (non-tumorigenic) epithelial cell lines. Since, drug resistance reduces the possibility of survival in breast cancer patients, Bag-1 might be an important player in drug response mechanism. In this study, to investigate the role of Bag-1 in cell survival pathway in healthy and tumor tissues from patients with breast carcinoma. Relative expression levels and interactions of Bag-1 and its partners including B-Raf, C-Raf, Akt proteins have been carried out by western blotting and immunoprecipitation. In this regard, Bad phosphorylation and 14-3-3 levels have been also considered. According to comparative experiments between normal and tumor tissues from same breast cancer patient, elevation of Bag-1 isoforms was obtained. Besides, in hormone positive, triple-negative, triple-positive and other type of tissues, expression and phosphorylation of B-Raf, C-Raf and Akt were revealed. In addition, Bad phosphorylation (Ser136) is dramatically increased in tumor tissues in correlation with the high expression of Bag-1, p-Akt, p-C-Raf and p-B-Raf. On the other hand, 14-3-3 levels did not show statistically significant increase suggesting that it has ubiquitous expression in the cell. However, when the results of all patients are came into account, its elevation from normal to tumor tissues is correlated with Bad phosphorylation. In Bag-1 immunoprecipitation experiments, phosphorylated forms of interaction partners which are C-Raf, B-Raf and Akt were viewed with western blot and interaction levels between normal and tumor state were observed. Thus, it might be claimed that the Bag-1/Raf/Akt complex is formed in the breast carcinoma cases. Also, the immunochemistry results might be the evidence of especially p-C-Raf, p-B-Raf overexpression in cytoplam of tumor cells with the high phosphorylation of Bad at the same cytosolic compartements in addition to its increased nuclear localization. In terms of ER, PR and HER2 receptor overexpressions in breast cancer cases, these findings highlight the role of Bag-1 on the axis of cell survival and death in breast cancer. Especially, interconnection between PI3K/Akt and MAPK pathways might be regulated with Bag-1 and its interaction with the players of these survival pathways. In the large frame, the outputs obtained from this study would potentially lead to the elucidation of cell survival mechanisms in human breast cancer and new therapeutic approaches could be defined via focusing on new drug targets.