Schızochytrıum Sp. Mikroalginden Biyokütle Üretimi Ve  üretilen Biyokütlenin İçeriğinin Tayini

thumbnail.default.alt
Tarih
2015-06-12
Yazarlar
Aral, Ahmet
Süreli Yayın başlığı
Süreli Yayın ISSN
Cilt Başlığı
Yayınevi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science And Technology
Özet
Bu çalışmada Schizochytrium sp. heterotrofik mikroalginin büyütülmesi, elde edilen biyokütle miktarının belirlenmesi ve hücre içindeki yağ oranının ölçülmesi üzerine çalışılmıştır. Tezin amacı son yıllarda giderek popüler konular arasına giren mikrolaglerden yağ asitleri ve biyodizel elde edilmesi gibi alternatif kaynaklar kullanılarak sürdürülebir, ölçeklendirilebilir, verimi yüksek, çevre dostu ve temiz bir üretim yöntemi oluşturmaktır. Bu amaçla  ATCC (Amerika Birleşik Devletleri) firmasından alınan Schizochytrium sp. hücresi kullanılarak küçük ölçekte üretim denemeleri yapılmış ve elde edilen veriler literatürde yer alan bilgilerle karşılaştırılmıştır. Schizochytrium sp.  ilk olarak fimgi ailesine mensup olarak sınıflandırılsa da daha sonra modern genetik ve moleküler yöntemlerle yapılan analizler sonrasında Thraustochytrids heterokont alg ailesine dahil edilmiştir. Daha çok deniz ekosisteminde yer alan organizma ile balıklar ve diğer deniz canlıları beslendiğinden bir anlamda insan besin zincirinin de bir parçası olduğu söylenebilir. DHA ve EPA tüketimine olan ilginin artmasıyla bu yağ asitlerini sentezleyen alternatif canlıların arayışına yönelik çalışmalar da hızla artmıştır.  Schizochytrium sp. de bu anlamda ticari olarak kullanılan başlıca alg türlerinden biridir. Bunun en önemli sebepleri Schizochytrium sp.’nin heterotrofik ortamda büyümesini ve çoğalmasını kolaylaştıran özelliklerinin bulunmasıdır ve ayrıca  organizmada uzun zincirli doymamış yağ asitlerinin sentezini sağlayan ve oksijenden bağımsız aktivite gösteren bir enzim kompleksinin varlığıdır. Bu sayede oksijen kısıtlı olduğunda bile mikroalg yağ sentezine devam edebilmekte ve hücre içinde biriktirmeyi sürdürmektedir. Tek hücreli bir canlı olduğu için de hücre içeriğinde sentezlenen moleküllerin  saflaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Kontrol mekanizması yüksek olan fermentörlerde heterotrofik koşullar altında üretimi diğer mikro alg türlerine göre daha kolay olan Schizochytrium sp. algi çok sayıda sektöre alternatif molekül ve ürün sağlamak amacıyla çalışılmaktadır. Ortamdaki çözünmüş oksijen konsantrasyonu, tuzluluk, karbon ve azot miktarı, karbon ve azot kaynaklarının türleri ve sıcaklık parametleri optimize edildiğinde sürekli ve verimli olarak üretime elverişli bir sistemin oluşturulması üzerine yapılan çalışmalar sonucunda Schizochytrium sp. ‘den DHA üretimi için sürdürülebilir sistemler kurulmuş ve pazarda ürünleri hizmete sunulmuştur.   DHA ve EPA gibi insan sağlığına faydalı ve esansiyel olan uzun zincirli yağ asitlerinin elde edilmesinin yanısıra, protein ve karbonhidrat gibi organik moleküllerin de ticari hacimlerde üretilebilmesine yönelik Schizochytrium sp. ile yapılan çalışmalar devam etmektedir. Hücre fizyolojisinde yağların çok farklı yerlerde ve rollerde görev aldığı bilinmektedir. Bu amaçla çok sayıda çalışma da yapılmaktadır. Bir hücrenin yağ içeriği çevresel koşullara bağlı olarak değişebilmekte ve bu değişimler hücrenin zarında çeşitli modifikasyonlara yol açabilmektedir. Yağ asitleri farklı sayıda karbon atomundan oluşan hidrokarbon zincirlerini içeren düz zincirli monokarboksilik asitlerdir. Bazı yağ asitlerinin hidrokarbon zincirleri hiç çift bağ içermez ve doymuş yağ asitleri olarak isimlendirilirken bazılarının hidrokarbon zincirleri bir veya daha fazla çift bağ içerirler ve doymamış yağ asidi olarak isimlendirilirler. Bu yağ asitlerinin metabolik aktiviteleri de karbon sayısı ile birlikte içerdikleri karbon çift bağının sayısına ve yerine bağlı olarak değişebilmektedir. Tezin çalışma konusunu oluşturan DHA (Docosahexaenoic Acid) ve EPA (Eicosapentaenoic acid)  omega-3 yağ asitleri uzun zincirli doymamış yağ asitleri grubuna girmektedir. Esensiyel yağ asitleri olmaları nedeniyle, insan vücudunda bu yağ asitleri üretilemediğinden beslenme yoluyla tüketilen gıdalardan alınmaktadır. Bunlar arasında en temel yeri balıklar ve kuru gıdalar oluşturmaktadr. DHA vücudumuzda birçok önemli fonksiyonun sağlıklı bir şekilde gerçekleşebilmesi için oldukça önemli bir yağ asididir. Hamilelik süresince bebeklerin ilk altı aylık döneminde göz, beyin ve sinir sisteminin gelişiminde DHA önemli bir rol oynamaktadır. Vücudumuzda beyin, sinir sistemi, sperm, serebral korteks ve retina başta olmak üzere birçok önemli fizyolojik noktanın temel yapıtaşıdır. Yetişkinler özellikle balık ve benzeri ürünlerle beslenerek, bebekler ise sadece anne sütü alımıyla bu yağ asitlerini temin edebilmektedirler. Bunların yanısıra kanserden kardiyovasküler hastalıkların önlenmesine kadar daha birçok alanda faydası bulunduğu, yapılan çalışmalarla gösterilmiştir. Omega-3 yağ asitlerinin gen düzeyinde de etkilerinin bulunduğu gösterilmiştir. Bazı gen ekpresyonlarında bu yağ asitlerinin rol aldığı ileri sürülmektedir. Doymuş yağ asitlerinin hidrokarbon zincirleri hiç çift karbon bağı içermediğinden, çok sıkı yapılar oluşturabilmektedirler. Eğer bu çok sıkı paketlenmiş yapılar kanda çoğalırlarsa LDL denilen ve halk dilinde kötü kolesterol olarak bilinen moleküllerin kandaki oranı yükselir ve damar yolu problemlerine yol açabilir. Doymamış yağ asitleri ise yapılarındaki çift bağ nedeniyle çok sıkı paketlenmiş yapılar oluşturamadıklarından  kanda HDL olarak bilinen iyi kolesterolün çoğalmasını sağlamaktadırlar. İyi kolesteroller hücre zarında geçirgenliği arttırdığı gibi kötü kolesterolün de karaciğere taşınıp vücuttan atılmasını sağlamaktadırlar.  Omega yağ asitlerinin beslenmedeki önemlerinin anlaşılmasına paralel olarak yıldan yıla tüketimlerinin de artması ciddi bir pazar ve ticari hacim oluşturmaktadır.Özellikle ticari değeri ve alternatif temiz enerji kaynağı olarak biyodizel üretimi çalışmaları için kullanılan mikrolgler bu anlamda geleceğin enerji kaynağı olarak da gösterilmektedir. İnsanların çok ciddi hastalıklara yakalanma oranlarının arttığı son yıllarda bu tarz sağlıklı ürünlere olan ilgi giderek artmaktadır ve özellikle omega yağlarının tüketimi çok hızlı artış göstermektedir. Ancak omega yağ asitlerinin temel kaynağının soğuk deniz balıkları olduğu düşünülürse giderek artan bu talebi uzun vadede karşılayamayacağı öngörülebilmektedir. Hem DHA içerikli paketlenmiş gıdaların geliştirilmesi hem de ilaç ve nütrasotik sanayiinde sürekliliği olan ürünlerin elde edilebilmesi için farklı kaynak arayışları için yola çıkılmıştır. Balıklardan elde edilen ürünler çevresel faktörlere çok bağımlıdır. Mevsimsel balık stoklarında yaşanan değişimler, denizlerdeki kirlilik oranları, üretilen ürünün tat ve kokusundan duyulan rahatsızlık gibi dezavantajlar nedeniyle balık yerine alglerden omega üretmek çok daha avantajlı bir yöntem olarak hızla gelişmektedir. Elde edilen ürünlerin vejetaryanlar tarafından kullanılamaması da diğer bir sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. Günümüzde yoğun olarak çalışılan farklı mikroalg türlerinin karşılaşılan bu tür sorunlara alternatif çözüm sunacağı düşünülmektedir. Gelişen biyolojik yöntemlerin ve teknolojinin yardımıyla hızla artan talebi karşılayabilmek amacıyla çalışmalar yapılmaktadır. Farklı mikroalg türleri ve kültür yöntemleri kullanılarak verimli sonuçlar elde edilmektedir Hem fototrofik hem de heterotrofik olarak üretilebilen bu canlıların son yıllarda hızla gelişen genetik ve moleküler biyolojik yöntemlerle verimlerinin yükseltilmesi üzerine de çalışmalar yapılmaktadır. Özellikle tuzlu su kaynağı ve güneşin yılın uzun bir döneminde aydınlattığı yerlerde fototrofik mikrolagler kullanılarak maliyetleri düşük üretim çalışmaları yapılmaktadır. Açık alanlarda tasarım olarak yüzey alanını arttıran ince cam ya da ışığı geçiren alternatif bir malzemeyle yapılmış borular kullanılarak büyütülen mikrolagler yağ asidi eldesi için kullanılmaktadır. Büyütülen mikroalgler önce filtre edilmekte, sonra kurutulmakta ve daha sonra da içeriği saflaştırılarak hücre içinde metabolize edilen yağlar ayrıştırılmaktadır. Bu üretim yönteminin dezavantajı olarak mikrolaglerin güneş ışığında ve çevresel faktörlere bağlı olarak düşük verimde biyokütle oluşturması gösterilmektedir. Çevresel faktörlere bağlı bir üretim yöntemi balıklardan elde edilen ürünlerin taşıdığı riskleri taşımaktadır. Bu nedenle heterotrofik yöntemlerle üretilebilen ve fermentör gibi özellikleri ve çalışma prensipleri uzun yıllardır deneyimlenen kapalı sistemlerde üretim denemeleri daha başarılı sonuçlar vermiştir. Ülkemizde de aynı amaca yönelik çalışmalar yürütülmektedir. Schizochytrium sp. heterotrofik ortamda temel karbon, azot ve tuz kaynakları kullanılarak büyütülebilen bir organizmadır. Heterotrofik koşullarda yağ metabolizmasının %70’lere ulaştığı bilinmektedir. Bu oranda yağ elde edilebilmesi için bilinen kaynaklardan anlaşılabildiği üzere hücrenin büyütülürken azot kısıtlamasına tabi tutulması gerekmektedir. Bu aşamada hücre ATP sentez metabolizması yavaşladığından hayatta kalabilme güdüsüyle metabolik olarak yağ sentezlemeye başlamaktadır. Bu çalışmada Schizochytrium sp. kullanılarak yüksek verimde biyokütle üretimi ve üretilen biyokütlenin içeriğinin tespit edilmesini amaçlayan deneysel tasarımlar oluşturulmuştur. Farklı miktarlarda diamonyum tartarat kullanılarak büyütülen Schizochytrium sp. mikroalginden elde edilen biyokütle miktarı ölçülmüş ve içeriğindeki yağ oranı belirlenmiştir. Öncelikle kök ve çalışma stokları olarak hazırlanan hücreler sıvı azot tankında saklanmıştır. Daha sonra iki aşamalı büyütme yöntemiyle erlenlere ekimler yapılmış ve 48 saat boyunca 25 ºC`de çalkalamalı inkübatörde muhafaza edilmiştir. Birinci aşamada sıvı azot tankından alınan çalışma stoklarından kompleks besiyerine ekim yapılarak hücrelerin çoğalması sağlanmıştır. İkinci aşamada ise çoğaltılan bu hücrelerden sıvı besiyeri ortamına ekim yapılmıştır. 48 saat inkübe edilen hücreler daha sonra elde edilen biyokütlenin besiyeri ortamından uzaklaştırılarak miktarının belirlenmesi için santrifüj yardımıyla filtrelenmiştir. Filtrelenen biyokütle 3 cm yarıçapında filtre kağıtlarına ince tabakalar halinde serilerek vakumlu bir kurutucuda kurutmaya alınmıştır. Kurutulan besiyeri hassas terazi vasıtasıyla tartılarak elde edilen kurutulmuş biyokütlenin miktarı tayin edilmiştir. Elde edilen yağ miktarının belirlenmesi için nile red boyama yöntemi ve hegzan ekstraksiyonu kullanılmıştır. Gelişen ve hızla değişen sağlıksız beslenme ve yaşam koşulları değerlendirildiğinde insanların ve hayvanların beslenmelerine daha özen göstermesi gerektiği önem kazanmaktadır. Bu amaçla tüketimi artan omega-3 ve omega-6 yağ asitlerinin üretimlerini sürdürülebilir ve bitkisel kaynaklı üretime elverişli şekilde geliştirmek kaçınılmaz olmuştur. Yapılan büyük ölçekte çalışmalar ve bu tezde yürütülen deneyler göstermektedir ki Schizochytrium sp. mikroalginden elde edilen yağ miktarları geliştirilebilecek üretim yöntemlerine elverişlidir.
Biotechnology has been working for the goods of livings in order to develop procceses and products for years. Human well-being takes the first place through these studies especially the production of essential metabolic molecules. Omega fatty acids are one of those significant molecules and getting more attraction at last decades. The process of obtaining these fatty acids from microalgae instead of cold marine fishes is a populer topic as well. There are many species metabolizing these omega fatty acids for example Crypthecodinium cohnii, Schizochytrium sp and Nannochloropsis sp.  Schizochytrium sp. was known to belong fimgi family but then substituted to under Thraustochytrids family as heterekont algae with the help of modern genetic and molecular methods. This alga produce high amount of DHA, which is an essential fatty acid for our metabolism. The current source of this polyunsaturated fatty acid is cold marine fishes but this system has many deficiencies like not being sustainable and environmentally friendly.   In this study, all the experiments were conducted to produce a high amount of Schizochytrium sp. microalgae biomass and so to obtain fatty acids within this one cell organism. The aim of the study was to develop a sustainable, environmentally friendly, scalable and non-toxic process in order to growth Schizochytrium sp. to obtain omega fatty acids. There are heterotrophic and phototrophic algae metabolising high amount of lipids, proteins and carbohydrates. Phototrophic algae production was populer at the beginings because the sun energy and salty water were free sources in the production processes. But then it was realised that the amount of biomass and lipid content was very low. Also this system dependent to sun and other environmental factors. This means that system has negative points as the fish based systems. Therefore, the heterotrophic methods are designed and many microalgae species are isolated which are able to grow heterotrophically and can produce high amounts of lipids, proteins and carbohydrates.  In this study Schizochytrium sp was acquired from ATCC and then stock cultures were prepared, one for seed stock and the others for working stocks. Two-stage growth method was used, firstly the main stock was inoculated to a complex medium for 48 hours under 25o C and then those cells were inoculated to defined mediums. Lastly, these cells were incubated for 48 hours and then the resulting content was centrifuged to obtain the biomass produced. This biomass was dryed then the resulting biomass is weighted. Then this biomass was smashed and subjected to hexane extraction in order to obtain the oil. Additionally, nile red staining also processed to quantify the total oil.  Results showed that a large-scale production method could be implemented with fermenter conditions to produce high amount of biomass and lipids.
Açıklama
Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2015
Anahtar kelimeler
Mikroalg, DHA, Omega 3, Microalgae, DHA, Omega-3
Alıntı