Transkripsiyon Faktörü P53 Tümör Supressör Proteininin P60-katanin (katna1) Promotoru İle Etkileşimi

Abstract

Hücre iskeleti, hücrenin hareketinde, şekil almasında, mitoz bölünmede, sitokinezde, hücre içi molekül taşınması gibi hayati fonksiyonlarda görev alan tüm sitoplazma boyunca yayılmış bir ağ yapısıdır. Hücre iskeleti üç farklı polimerik yapıdan meydana gelir. Bunlar mikrofilamentler, ara filamentler ve mikrotubuller olarak adlandırılırlar. Mikrofilamentlerin hücrenin şekil kazanması sırasında, sitokenezde , organellere tutunma yüzeyi hazırlanmasında, kas hareketleri gibi fonksiyonel birçok hücre içi görevleri vardır. Ara filamentler ise hücreye mekanik destek sağlarlar ve hücreler arası bağların oluşumunda görevlidirler. Bir diğer hücre iskeleti elemanı da mikrotübüllerdir. Mikrotubuller hücre bölünmesi esnasında kromozomların kutuplara çekilmesinde, hücrenin morfolojik yapısının oluşmasında, hücrede vezikül taşınmasında, hücrenin hareket edebilmesinde, nöronlarda akson oluşumunda ve nöronal şeklin meydana gelmesinde önemli rol oynarlar. Mikrotubuller alfa (α-tubulin) ve beta (β-tubulin) heterodimerlerinin oluşturduğu polimer yapılı proteinlerdir. α ve β heterodimerlerinin hızlı bir şekilde polimerizasyonu ve depolimerizasyonu ile mikrotubuller dinamik bir yapı kazanmaktadır ve bu dinamizme “dinamik kararsızlık” adı verilir. Hücreler ihtiyaç durumuna göre bu mekanizma ile mikrotubullerini yeniden yapılandırmaktadırlar. Mikrotubullerin uzayıp kısalmasından bu mekanizma sorumludur. Uzama fazı mikrotubullerin uçlarına serbest tubulin hetero dimerlerinin eklenmesiyle oluşurken, kısalma fazıında mikrotubuller uçlarından tubulin dimerlerini kaybederler. Mikrotubullerin kesilip kısalması bir diğer dinamik mekanizmadır ve nöron morfolojisi açısından çok önemlidir. Çünkü dinamik kararsızlık, nöron morfolojisinin oluşması için gereken dallanma sürecinde hız ve zaman açısından yetersiz kalır. Bu nedenle mikrotubullerin hücre içi hareketini açıklamaya çalışan diğer mekanizmalar devreye girmektedir. Bunlardan birisi de “kes ve koş” mekanizmasıdır. Mikrotubullerin kesilmesinde görev alan enzimler katanin, spastin ve fidgetindir ve bunlar AAA ailesi ATPaz üyeleridir. Mikrotubullerin kesilmesi hareketi açısından ve taşınabilmesi için önemli bir durumdur. Çünkü mikrotubullerin hücre içerisindeki hareketleri boyları ile ters orantılıdır. Uzun mikrotubuller harekete direnç gösterirken kısa mikrotubuller daha efektif bir şekilde hareket ederler. Ancak, mikrotubuller tekrar uzun hale geldiklerinde hareket yeteneklerini kaybetmektedirler. Katanin ve spastin benzer çalışma mekanizmaları içerirler. Ancak mikrotubullerin farklı form ve boyutlarda kesilmelerini sağlarlar. Spastin SPG4 geni tarafından kodlanır. Katanin ise heterodimerdir ve KATNA1 geni tarafından kodlanan p60-katanin ve KATNB1 geni tarafından kodlanan p80-katanin alt birimlerinden oluşur. p60-katanin enzimatik aktivite gösterir ve AAA ATPaz bölgesi içerir. p80-katanin ise enzimatik aktivite içermez ancak p60-kataninin aktivitesini düzenler. Yapılan araştırmalar sonrasında katanin, nörolojik hastalıklar ile ilişkilendirilmiştir. Kataninin sinir sisteminde oldukça yoğun olarak ifade edilir ve baskılandığı zaman mikrotubul uzunluğunda artışa neden olur. Bu artış ile birlikte akson gelişiminin olumsuz etkilenmesi ve mikrotubullerin sentrozomlarda birikmesi görülür. Bu nedenle, kataninin mikrotubullerin sentrozomdan ayrılması ve akson büyümesi için hayati önem taşır. Mikrotubullerin sabit kalmasını sağlayan tau proteini hiperfosforilasyon sonucu mikrotubullerden ayrılarak stabilizasyonu engeller. Böylece katanin mikrotubulleri kolayca kesebilir. Bu yüzden kataninin gen anlatım süreci ile düzenlenmesi önem taşımaktadır. p53, tümör baskılayan protein olarak hücrenin birçok mekanizmasında yer almaktadır. Hücre döngüsünün düzenlenmesinde, metabolizmada, apoptozun tetiklenmesinde, DNA replikasyonunda, bağışıklık cevaplarında, proliferasyonda ve diferansiyasyon kaskadında önemli görevleri vardır. Daha önce grubumuzun yaptığı çalışmalar sonucunda, nöronlarda PKC’nin yapısında ve aktivitesinde meydana gelen değişimlere bağlı olarak hücre siklusu belirteçlerinden siklin D1 üzerinde oluşan değişiklikler incelendiğinde, PKC aktivasyonu ile birlikte nöronal uzantıların retraksiyonu görülmüştür. Burada yapılan analizlerle de p60-katanin protein seviyesinde artış görülen hücrelerde nöronal farklılaşma ile de ilişkili p53 transkripsiyon faktörünün de arttığı gösterilmiştir. Buradan yola çıkarak, bu çalışmada ise p60-katanin’in regülatör bölgeleri tespit edilerek p53 transkripsiyon faktörünün KATNA1 geninin regülasyonu üzerine olan muhtemel etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Öncelikle p60-katanin promotor bölgesinde olası p53 bağlanma bölgeleri biyoinformatik yöntemler ile saptanmıştır. Bu da, KATNA1 geninin p53 tarafından regüle edilebileceğine dair önemli bir ipucu olmuştur. Daha sonra p60-katanin bölgeleri (336 bp promoter, 448 bp 5’UTR, 784 bp promoter + UTR, 2682 bp intron + UTR ve 3000 bp promoter + UTR + intron ) klonlanmıştır. p60-katanin promoter , p60-katanin UTR, p60-katanin promoter + UTR , p60-katanin promoter + p60-katanin UTR + p60-katanin intron bölgeleri polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmış ve gerekli enzim kesimlerinden sonra hazırlanmıştır. Bundan sonra, p60-katanin ekspresyonunda etkili regülatör bölgeleri lüsiferaz assay ile karakterize edilmiştir. Lusiferaz assay yöntemi ile 5’-UTR bölgesinin transkripsiyon aktivitesini arttırdığı ve tahmin edilen promoter bölgesinin intron varlığında transkripsiyon aktivitesini düşürdüğü bulunmuştur. Bunun sonucunda, intron-1 bölgesinin repressor etkisi görülmüştür. Olası promotor bölgesi biyoinformatik programı ile analiz edildiğinde, guanin ve sitozin (CpG) dinükleotidlerince zengin olduğu bulunmuştur. Bunun yanı sıra yaptığımız analizler sonucunda bu bölgede bir CpG adacığın varlığı (-615 ile -918 bç arası) tespit edilmiştir. Chromosome Immunoprecipitation (ChIP) ve Elektrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) yöntemleri ile p60-katanin üzerinde p53’ün bağlandığı gözlemlenmiştir. Daha sonra da protein düzeyinde p53’ün ekspresyonunun artışı western blotlama yöntemi ile incelenmiştir. Diğer taraftan bu sonuçlar, gen ekspresyon sürecinin anlatıldığı transkripsiyon basamaklarını kapsayan mRNA düzeyinde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile de gösterilmiştir.

Cytoskeleton is a network of filamentous structures which are spread throughout the cytoplasm. Cytoskeleton play roles in vital functions such as movement of the cells, cell shape, mitosis, cytokinesis, intracellular transport of molecules. Cytoskeleton consists of three distinct polymeric fibers. Microfilaments are required for maintenance of cell shape, cytokinesis, separation of the dividing cell into two and cell surface preparation for adherence. Other component of cytoskeleton, intermediate filaments provide mechanical strenght and mechanical linkage. The final member of cytoskeleton is microtubules that have crucial roles such as drawing the chromosomes apart in mitosis, shaping morphological structure, intracellular traffic to carry vesicules, cell motility, formation of axons and dentrites and therefore, the neuronal structure. Microtubules are structural polymer proteins and consist of α-tubulin and β-tubulin heterodimers. Microtubules are dynamic structures resulting from rapid polymerization and depolymerization of tubulin monomers by a process known as “dynamic instability”. Reconfiguration of the microtubules by these mechanisms is responsible for microtubule growing and shrinking. When dynamic instability, speed and time for branching for special neuronal morphology are considered, it can be easily understood that cells need another mechanism to explain the movement of intracellular microtubules. “Cut and run” model proposes that microtubules are cut into small pieces by severing enzymes; katanin, spastin and fidgetin. These enzymes are members of AAA family of ATPases. Because microtubules lose their ability to move when they are long, microtubule severing is important in terms of movement capacity. Katanin and spastin have same working mechanism, but, they provide different severing approach. Spastin encoded by SPG4 gene. Katanin is a heterodimer of p60-katanin encoded by KATNA1 gene and p80-katanin encoded by KATNB1 gene. p60-katanin has the enzymatic activity and it has AAA ATPases region but p80-katanin enzyme do not have the enzymatic activiy. According to studies, katanin is associated with neurologic diseases. Katanin is ubiqutiously expressed in nervous system and its inhibition or overexpression impairs axon formation. Thus, it is clearly understood that katanin has vital role for microtubule reorganisation and axon growing. Hypophosphorylated form of tau protein normally provides stabiliziation of microtubules and protects microtubules from the severing enzymes. Hyperphosphorylation of tau results in dissociation of tau from microtubules and thus, microtubules become accesible for severin enzyme katanin. The enzymatic activity of katanin is proportional to level of enzyme so regulation of katanin protein level via transcription mechanism comes into prominence. p53 is important for many cellular mechanisms as a tumor supressor in processes such as cell cycle regulation, metabolism, apoptosis, DNA replication, immunity responses, proliferation and differentiation. In our previous study, we have shown that neuronal processes were retracted upon PKC activation following increases in both p60-katanin and p53 levels in neurons. This result led us to analyze changes in p60-katanin, which is organizing the neuronal cytoskeleton. We showed that cells which have enhance p60-katanin protein level also had increase in p53 transcription factor, which is related on neuronal differentiation. In this study, we aimed to identify regulatory DNA sequences of KATNA1 gene and possible regulation of p60-katanin by p53 trasnscription factor. For this purpose, we first decided to characterize regulatory regions of KATNA1 gene. Primarly, the putative transciptional regulatory regions of p60-katanin were identified by bioinformatic methods. p60-katanin regions (336 bp promoter, 448 bp 5’UTR, 784 bp promoter + UTR, 2682 bp intron + UTR and 3000 bp promoter + UTR + intron) were cloned for the identification of their regulatory activities on p60-katanin expression by Luciferase assay. Then, p60-katanin promoter, p60-katanin UTR, p60-katanin promoter + UTR and p60-katanin promoter + p60-katanin UTR + p60-katanin intron regions were amplified by PCR and after required restriction all regions prepared. We identified that 5’-UTR region enhanced transcriptional activity of the reporter gene, but not putative promoter region and the presence of the intron decreased the activity. Thus, expression of katanin-p60 seems to be regulated via 5’-UTR, and intron-1 might have repressor elements. When potential gene regulatory regions were analyzed by bioinformatics software, presence of a CpG island that comprising promoter and 5’-UTR regions (from -615 to -918 bp) was identified. Next, we identified p53 consensus sequence on KATNA1 gene bioinformatically. Therefore, it is thought that KATNA1 gene could possibly be regulated by p53 transcription factor. We started with analyzing the binding of p53 to the corresponding promoter region. To further confirm the specificity of the p53 binding to KATNA1 promoter was confirmed by Chromosome Immunoprecipitation (ChIP) and also by Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) using oligonucleotides including related transcription factor binding sites. On the other side, our observation indicated that, p53 acts as an activator or repressor KATNA1 gene promoter. The result for KATNA1 gene was confirmed in mRNA level by performing real time PCR.