Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11527/14527
Title: Otofaji Ve Apoptoz İlişkisinin Bag-1, Bcl-2 Ve Beclın 1 Üzerinden İncelenmesi
Other Titles: Investigation Of The Autophagy And Apoptosis Relation Through Bag-1, Bcl-2 And Beclin 1
Authors: Doğanay, Gizem Dinler
Alkurt, Gizem
10123776
Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji
Molecular Biology and Genetics
Keywords: BAG-1
Apoptoz
Otofaji
BAG-1
Apoptosis
Autophagy
Issue Date: 31-Aug-2016
Publisher: Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science And Technology
Abstract: BAG (Bcl-2 ilişkili athanogen) ailesi, maya, bitki ve hayvanlarada korunmuş olan ve apoptoz, tümorigenez, sinyalleşme, hücre üremesi ve otofaji gibi hücredeki pek çok önemli mekanizmada rol oynayan, çok fonksiyonlu proteinlerden oluşur. Hsp70/Hsc70 gibi hem normal hem stres altındaki koşullarda hücre dengesinde etkili moleküler şaperonlar ile etkileşimde bulunmaları, bu protein ailesini oldukça önemli kılmaktadır. BAG-1 anti-apoptotik proteini, ısı şok proteinleri, moleküler şaperonlar, sinyal molekülleri ve diğer anti-apoptotik etkenler ile etkileşime giren, BAG ailesinin önemli bir üyesidir. BAG-1’in bilinen ana üç izoformu, BAG-1L, BAG-1M ve BAG- 1S bulundukları dokulara ve hücrelere göre özelleşmiştir. Transkripsiyon, apoptoz, hücre proliferasyonu, hormon aktivitesi ve hücre migrasyonu gibi pek çok hücresel yolakta oynadığı roller sebebiyle BAG-1, hücrenin yaşamını devam ettirmesini sağlayan önemli bir protein olarak görülmektedir. Meme kanseri başta olmak üzere bir çok kanser tipinde anlatımı düzeyine yüksek oranda rastlanılmaktadır. Bu nedenle kanser oluşum ve gelişim mekanizmalarında incelenmesi kayda değer bir proteindir. Organizma içinde homestasiyi sağlamak açısından önemli bir mekanizma olan apoptoz, dış uyaranlara bağlı olarak hücrenin programlı ölümünü sağlar ve morfolojik değişikliklere yol açar. Hücrede apoptoz mekanizması, ekstrinsik ve intrinsik yolak olmak üzere iki farklı şekilde çalışabilir. Ekstrinsik yani dış etkenlere bağlı yolakta hücre membranında bulunan Fas reseptörüne Fas ligandının bağlanmasıyla başlayan ölüm sinyali hücre içerisinde kaspaz-8’in aktivasyonu ile devam eder ve mitokondriden pro-apoptotik faktörlerin salınması gerçekleşir. İntrinsik yani içsel yolakta ise mitokondri membranının geçirgenliğine bağlı olarak mitokondriden sitokrom-c salınımı ile başlayan ve apoptozom oluşumu ile devam eden bir apoptotik mekanizma mevcuttur. Sitokrom-c salınımı hücre içerisinde mitokondri üzerinde bulunan pro-apoptotik ve anti-apoptotik proteinler arasındaki dengenin bozulması nedeniyle gerçekleşmektedir. Bu dengenin bozulmasında pek çok etken rol oynamaktadır. Öte yandan bu proteinler, Bcl-2 protein ailesi üyesi olup pro-apoptotik olarak Bax, BAK, BAD, anti-apoptotik olarak ise Bcl-2 ve Bcl-xL’dir. BAG-1, Bcl-2 ile olan etkileşiminden dolayı apoptotik yolaklardaki etkenlerden biri olarak görülmektedir. BAG-1’in major rollerinden biri pro-apoptotik faktörlerin örneğin sitokrom-c’nin mitokondriden salınımını engellemektir. Ayrıca BAG-1’in laboratuvarımızda gerçekleştirilen önceki deneyler sonucunda, Akt, c-Raf, Hsp70 ve birkaç protein ile birlikte bir kompleks oluşturarak Bad’ın fosforillenmesini sağlayarak hücre sağkalımına neden olduğu ortaya çıkarılmıştır. Öte yandan, hücrenin stres ortamına uyum sağlayarak homeostaziyi sağlamasında görev alan mekanizmalardan biri otofajidir. Otofaji kelime anlamı olarak hücrenin kendi kendini yemesi anlamına gelmekle beraber hücre farklılaşması, yaşlanma, metabolizmanın regülasyonu ve hücre ölümünde de rol almaktadır. Ayrıca yapılan son çalışmalar ile kanser ve nörodejeneratif hastalıkların oluşmasına neden olan etkenler arasında gösterilmektedir. Atg (otofaji ilişkili gen) protein ailesi ve Beclin 1 otofaji mekanizmasının başlangıcı, devam ettirilmesi ve sonlandırılmasında rol alan önemli proteinlerdir. Beclin 1, Bcl-2’nin interaksiyon partneri olarak keşfedilmiş olup tümörigenez başta olmak üzere pek çok mekanizmada görev almaktadır. Bcl-2 protein ailesine özelleşmiş olan BH3 domanine bulunduran Beclin 1, Bcl-2 dışında bir diğer aile üyesi olan Bcl-xL ile de etkileşime sahiptir. Beclin 1’in Bcl-2 veya Bcl-xL ile olan etkileşimin farklı etkenlerden dolayı bozulması sonucunda hücre apoptoz ve otofaji mekanizmaları arasında bir seçim yaparak canlılığını devam ettirmekte veya ölüm yolunu seçerek canlılığına son vermektedir. Bu çalışmada, Bcl-2 ile ilişkisi olduğu bilinen BAG-1’in Beclin 1 ve Bcl-2 arasındaki etkileşim ve bu etkileşim sonucu hücrenin apoptoz-otofaji mekanizmaları arasındaki seçimindeki rolünün anlaşılması hedeflenmiştir. Bu amaç ile BAG-1 anlatımı arttırılmış ve azaltılmış MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde öncelikli olarak BAG-1 izoformlarının varlığı immunblotlama ile gösterilmiştir. Ardından BAG-1 anlatımına bağlı olarak Beclin 1 anlatım düzeyinde herhangi bir değişiklik olup olmadığı incelenmiştir. Kayda değer bir değişiklik gözlenmemiş ve bu nedenle Beclin’in fosforilasyon düzeyindeki olası farklılığın tespiti için immunblotlama deneyi gerçekleştirilmiştir. Beclin fosforilasyonunun seviyesi BAG-1 anlatımı azaltılmış hücrelerde kontrol hücrelerine kıyasla artmış olarak gözlemlenmiştir. Ayrıca, Beclin 1 ve Bcl-2 arasındaki etkileşimde BAG-1’in bulunma olasılığı göz önünde bulundurularak öncelikli olarak immunçökeltme deneyleri yapılmıştır. Bu deneylerde Beclin 1 ile doyurulmuş IgG boncuk kullanılarak BAG-1 varlığı tespit edilmiştir. Gözlemlenen bu etkileşimin lokasyon açısından incelenebilmesi amacı ile immunsitokimya deneyi gerçekleştirilmiştir. Bu etkileşimin Bcl-2’nin köprü görevi yaparak direkt veya indirekt olduğunu gösterebilmek için PRISM programı kullanılarak olası interaksiyonlar incelenmiştir. Bu interaksiyonlar günümüzde bulunan PDB bilgileri ışığında tam olarak gösterilememiş olup proteinlerin tüm yapısal modellemeleri yapıldığı takdirde gösterilecektir. BAG-1’in Bcl-2 ile etkileşimi nedeniyle otofaji mekanizması üzerindeki herhangi bir etkisi olup olmadığını gösterebilmek amacı ile BAG-1 anlatım düzeyi arttırılmış ve azaltılmış MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde otofajik regülasyonda görev alan proteinlerin anlatım düzeyi kontrol edilmiştir. Aynı zamanda, otofaji inhibitörü 3-MA kullanılarak BAG-1’in de ilişkili olduğu proteinlerden biri olan Akt’ın anlatım düzeyi ve Bad’ın fosforilasyonuna olan etkisi MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde incelenmiştir. Laboratuvarımızda daha önceden gerçekleştirilen deneylerde, BAG-1’in de içerisinde bulunduğu Bad fosforilasyonuna neden olan kompleksteki kinazlardan hangisinin tam olarak Bad fosforilasyonunu gerçekleştirdiği bulunamamıştır. Ancak bu çalışmada kullanılan 3- MA ve GW-5074 inhibitörleri çalışmaları ile Bad fosforilasyonunun kinaz özelliği bulunan Akt proteininin gerçekleştirdiği gösterilmiştir. Bu çalışma ile, ortak interaksiyon partnerleri bulunan (Bcl-2) ve etkileşimleri bilinmeyen anti apoptotik özelliğe sahip BAG-1 ve Beclin 1 arasındaki ilişki incelenmiştir. Bu olası etkileşim, hücre sinyal yolaklarında büyük bir role sahip olan apoptoz ve otofaji mekanizmalarını etkilemekte olup hücrenin sağkalımı veya ölümü seçeceği yolda önemli bir role sahip olabilir. BAG-1 gerek Bcl-2 interaksiyonu ile sahip olduğu anti-apoptotik özelliği ile gerek Beclin 1 gerçekleştirdiği olası etkileşim sonucunda hücre sağkalımında kritik bir protein olabileceğini bu çalışma ile göstermiş olduk. BAG-1 proteini daha detaylı çalışılması gereken ve özellikle meme kanserinde yüksek bir biyomarkör değeri taşıyan bir protein olup detaylı bir şekilde çalışılması gerekmektedir.
BAG (Bcl-2 associated athanogene) family belongs to a group of multifunctional proteins conserved in yeasts, plants and animals and has significant roles in crucial metabolic pathways such as apoptosis, tumourigenesis, signaling, cell proliferation, and autophagy. BAG-1 is a member of BAG family proteins and known as an anti-apoptotic protein. BAG-1 has three major isoforms including BAG-1L, BAG-1M ve BAG-1S that are translated owing to the use of alternative translation start sites. BAG-1 localizes in different parts of cells and interacts with several molecular targets. Thereby, BAG-1 modulates important regulatory pathways including transcription, apoptosis, cell proliferation, hormone action, cell migration with its interaction partners. Apoptosis, which is an important mechanism for maintaining homeostasis, induces morphological changes and programmed cell death due to external stimuli. Apoptosis takes place through two major mechanisms, which are extrinsic and intrinsic pathways. Extrinsic pathway is activated by binding of Fas ligand to Fas receptor on the cell membrane, followed by activation of caspase-8 and release of pro-apoptotic factors from the mitochondria. Intrinsic pathway is activated by release of cytochrome-c from mitochondria due to membrane permeability, followed by apoptosome formation. Cytochrome-c release occurs due to the imbalance between pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins on the mitochondria. There are many factors influencing this imbalance. These proteins include pro-apoptotic Bcl-2 members Bax, BAK, BAD, and anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-xL. BAG-1 is accepted as a factor in apoptotic pathways due to its interaction with Bcl-2. One of the major roles of BAG-1 is to prevent the release of pro-apoptotic factors such as cytochrome-c from the mitochondria. Furthermore, by forming a complex consisting of Akt, c-Raf, Hsp70 and several proteins leads to Bad phosphorylation and induces cell survival. In addition, autophagy is one of the mechanisms for adaptating to stress conditions and maintaining homeostasis. Autophagy means “self-eating”, and has roles in cell differentiation, aging, regulation of metabolism, and cell death. Moreover, it has been shown to involved in development of cancer and neurodegenerative diseases. Atg family proteins and Beclin 1 are important proteins involved in autophagy mechanism. Beclin 1, which is discovered as Bcl-2 partner, has roles in many mechanisms, especially in tumourigenesis. Beclin 1 has BH3 domain, which is specific to Bcl-2 protein family, and interacts also with Bcl-xL. Cells make a decision between apoptosis and autophagy due to disrupted interaction between Beclin 1 and Bcl-2 or Bcl-xL. The aim of this study is to investigate the interaction of BAG-1, with Beclin 1 and Bcl-2, and its role on balance between apoptosis and autophagy. To this end, in BAG-1 overexpressed and silenced breast cancer cells, BAG-1 isoforms were investigated. Then, Beclin 1 expression and phosphorylation levels were checked upon altered BAG-1 expression. Beclin 1 phosphorylation levels were decreased in Bag-1 silenced MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells. Besides, to understand whether BAG-1 and Bcl-2 interact, immunoprecipitation assays were carried out by using IgG beads. BAG-1 isoforms and Beclin 1 were observed together. Besides, probable interaction of BAG-1 and Beclin 1 was predicted via PRISM server. The BH3 domain of Beclin 1 and BAG domain of BAG-1 interacted. To figure out the possible role of BAG-1 in autophagic regulation, Atg proteins expression levels were examined by immunoblotting. Also, breast cancer cells treated with autophagy inhibitor 3-MA and c-Raf inihibitor GW-5074 then, Akt and Bad expression and phosphorylation levels were analyzed. C-Raf inhibitor did not result in a change in the phosphorylation level of Bad. However, phosphorylation level of Bad was decreased under 3-MA treatment although BAG-1 overexpression. As a result, Akt might be the kinase in the complex, where BAG-1 is involved and phosphorylate Bad to induce cell survival. As a conclusion, BAG-1 might be interacting with Beclin 1. By this study, it is highlighted that BAG-1 might have a role in autophagic regulation mechanism which contents Akt pathway in cell survival. BAG-1 is a remarkable protein - as a potential biomarker especially in molecular mechanisms underlying breast cancer and further - studies are required to understand the role of BAG-1 in breast cancer.
Description: Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2016
URI: http://hdl.handle.net/11527/14527
Appears in Collections:Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Yüksek Lisans

Files in This Item:
There are no files associated with this item.


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.