Mtorc1 Aracılı Otofajide Anti-apoptotik Bag-1-akt Etkileşiminin Meme Kanseri Hücre Hatlarında Araştırılması

Abstract

BAG-1 (Bcl-2-assosiye protein) ilk olarak 1995 yılında, apoptozu önleyici BCL-2 proteininin etkileşim partnerleri araştırılırken iki ayrı çalışma grubu tarafından keşfedilmiştir. Ardından, detaylı bir şekilde araştırılmaya başlanan BAG-1 proteininin çeşitli izoformlara sahip olduğu ve BCL-2 apoptoz düzenleyicisi, HSC70/HSP70 ısı şok proteinleri, nükleer hormon reseptörleri, DNA, ubikuitinlenme/proteazom mekanizması, RAF-1 kinaz gibi birçok hücresel hedefi olduğu bulunmuştur. Etkileştiği hücresel komponentlerden de anlaşıldığı üzere BAG-1 proteini apoptoz, transkripsiyon, proliferasyon ve sinyal yolakları gibi pek çok hücresel yanıtta etki göstermektedir. BAG-1 geni tek bir mRNA molekülü üzerinde yer alan alternatif translasyon başlama bölgeleri sayesinde üç temel izoform protein kodlamaktadır: BAG-1S (36 kDa), BAG-1M (46 kDa) ve BAG-1L (50kDa). Bunların yanısıra, 29 kDa'luk minör BAG-1 izoformu da mevcuttur. BAG-1 izoformlarının sahip oldukları farklı amino uçları, hücre içi lokalizasyonlarında belirleyici özellik taşımaktadır. BAG-1L proteini taşıdığı nükleer lokalizasyon sinyal sekansı sayesinde genellikle çekirdekte yer alırken, bu sinyal sekansını taşımayan BAG-1S izoformu sitoplazmada lokalize olmaktadır. BAG-1M proteini ise nükleer sinyal sekansının bir kısmını içermekte ve hem sitoplazmada hem de çekirdekte bulunabilmektedir. Bahsi geçen alternatif varyantların farklı bölgelerde lokalize olması, bu proteinlerin işlevsel farklılıklarına bir açıklama getirebilmektedir. Örneğin, yalnızca BAG-1L izoformu nükleer hormon reseptörleri, östrojen reseptörleri ve androjen reseptörleriyle etkileşerek onların transkripsiyonel aktivitelerini arttırabilmektedir. Bu izoformlar, BAG-1'in hücresel etkilerine aracılık etmede oldukça önemli görev üstlenen "BAG" domeninin yer aldığı ortak bir karboksi ucuna sahiptir. Bahsi geçen "BAG" domeni, BAG-1 proteinin HSC70/HSP70 ısı şok proteinleriyle, RAF-1 serin-treonin protein kinaz, Bcl-2 ve hepatosit büyüme faktörü (HGF) reseptörü ile olan etkileşimlerine aracılık etmektedir. Bütün Bag-1 izoformlarının Bag domenine sahip olmalarının yanında, ortak olarak ubikuitin-benzeri domeni (ULD) içerdikleri de bilinmektedir. ULD domeninin görevi net olarak bilinmese de evrimsel olarak korunmuşluğu ve proteozom sistemi ile olan ilişkisi, bu domenin stres toleransı için gerekli olduğuna işaret etmektedir. BAG-1 ULD, BAG-1'in proteozom ile etkileşmesi için gereklidir. Yakınlarda yapılan bir çalışmada ise, BAG-1'in spesifik proteinlerin yıkımı esnasında şaperon ve proteazomun işlevlerini koordine ederek etkidiği görülmüştür. Farklı BAG-1 izoformlarının farklı anti-apoptotik fonksiyonlar göstermesi, N-terminallerinin fonksiyonları için önemli olduğunu göstermektedir. Önceki çalışmalarda gösterildiği üzere, amino ucu BAG-1'in hormon reseptörlerine, transkripsiyon faktörlerine, belli DNA promotörlerine bağlanması için önemlidir. BAG-1'in N-ucunda bir hekzapeptit tekrar bölgesi bulunmaktadır. BAG-1L ve BAG-1M'de bu tekrar bölgesinin tamamı bulunurken, BAG-1M'de yalnızca bir parçası bulunmakta; ancak BAG-1 minör izoformunda bu bölge bulunmamaktadır. Hekzapeptit tekrar bölgesinin görevi bilinmemesine rağmen, BAG-1'in anti-apoptotik fonksiyonu ile ilişkili olduğu düşünülebilir. Çünkü, tekrar bölgesinin tamamını içeren BAG-1L ve BAG-1M izoformları güçlü anti-apoptotik etkiye sahiptir. Bu bölgenin silinmesi, proteinin stabilitesini büyük oranda bozmaktadır. Çoğu malignant kanser türünde olduğu gibi, meme kanserinde de apoptotik sinyal yolakları düzensiz işlemektedir. Bu bağlamda, araştırmacılar tarafından yapılan birçok klinik çalışma, BAG-1 proteininin potansiyel prognostik veya öngörücü markör olarak üstlendiği rolü açıklamaya çalışmıştır. Bu çalışmaları desteleyen in vitro ve klinik çalışmalardan elde edilen bir bulguya göre, BAG-1 ifadesi normal meme epitel hücrelerine kıyasla meme kanseri hücrelerinde artış göstermektedir. BAG-1 proteinin çok çeşitli hücresel işlevlere sahip olduğu bilinmekle birlikte, söz konusu fonksiyonların altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında sahip olunan bilgiler oldukça azdır. Çoğu proteinin bir ya da birden fazla protein kompleksinin bir parçası olduğu göz önünde bulundurulduğunda, proteinler aracılığıyla gerçekleşen biyolojik proseslerin anlaşılmasında protein-protein etkileşimlerinin bilgisine sahip olmak çok büyük önem taşır. BAG-1'in birçok görevi yerine getirdiği bilinmesine rağmen, yalnızca birkaç etkileşim partneri bilinmektedir. Çok çeşitli biyolojik işlevleri yerine getirmesi, yukarıda da bahsedildiği üzere etkileşim partnerlerinin çeşitliliğini akla getirmektedir. Daha önceki sonuçlarımıza göre, MCF-7 hücreleri ile yapılan çalışmalarda, BAG-1 proteini aşırı ifade ettirilmiş ve RAF-MEK-ERK sinyal yolağında rol alan proteinlerin seviyeleri incelenmiştir. BAG-1 aşırı ifadesi sonucunda, B-RAF, C-RAF, ERK1/2, MEK1/2 and fosfo-MEK1/2 (Ser221) proteinlerinin ifadesinde artış gözlenmiştir. B-RAF-AKT etkileşiminin hücre çoğalmasını teşvik ettiği ve hücre ölümünü engellediği bilindiğinden, fosfo-AKT (Ser473) protein ifadesi de kontrol edilmiş ve artan BAG-1'in ifadesi ile birlikte fosfo-AKT (Ser473) protein seviyesinin de arttığı görülmüştür. Yapılan immunositokimya ve immünoçöktürme çalışmaları sonucunda, BAG-1'in B-RAF, fosfo-AKT (Ser473), BCL-2, HSP70 ve C-RAF ile birlikte bulunduğu sonucu ortaya çıkarılmıştır. Yaptığı çalışmalarla BAG-1 ve AKT arasındaki olası etkileşimi ortaya çıkaran Demir, S., BAG-1'in aşırı ifade ettirildiği MCF-7 hücrelerinde hücre ölümünü önleyen ve sağkalımı sağlayan pro-apoptotik BAD'ın Ser136 bölgesinden yabanıl tip hücrelere göre daha çok fosforile olduğunu gözlemlenmiştir. Literatürde, BAD'ın nöronal hücrelerde temel olarak AKT kinaz tarafından fosforillenmekte ve B-RAF ve C-RAF tarafından da aktive edilmekte olduğunun bilinmesinin yanında, başka bir çalışmada da BAG-1'in AKT, B-RAF, BCL-2 ve HSP70 ile bir arada bulunduğu bir kompleksin BAD'ı fosforile ederek hücre sağkalımına neden olduğu bulunmuştur. BCL-2 ailesinin pro-apoptotik üyelerinden biri olan BAD, aynı ailenin BCL-2, BCL-xL gibi sağkalım öncesi (prosurvival) elemanlarına bağlanıp onların etkilerini baskılayarak hücreyi apoptoza teşvik etmektedir. Ancak Ser136 bölgesinden fosforillenen BAD, sitozolde yer alan 14-3-3 proteinin bir hedefi olarak tanınıp kesilmekte (sequester) ve böylece BAD, mitokondri zarında yer alan BCL-2 veya BCL-xL ile etkileşememektedir. Bu çalışmalar ışığında, BAG-1'in C-RAF, B-RAF, HSP70, fosfo-AKT (Ser473) ve BCL-2 ile birlikte bulunduğu kompleksin, hücre apoptozunu önlemek için BAD'I Ser136 bölgesinden fosforillediği fikri öne sürülmüştür. Demir'in çalışmalarında, AKT kinazın BAG-1'in hücre sağkalımındaki anti-apoptotik işleyişi ile ilgili olabileceğini göstermesine dayanarak, bu tez kapsamında BAG-1, ana hücre sağkalımı yolaklarından biri olan (PI3K)/AKT/rapamisinin memeli hedefi (mTOR) yolağında araştırılmıştır. Son yıllarda tümör oluşumu sırasında değişen majör sinyal yolakları araştırılırken, bahsi geçen AKT kinazın apoptoz, proliferasyon, farklılaşma, metabolizma gibi pek çok hücresel prosesin önemli bir düzenleyicisi olduğu ortaya çıkmıştır. Bu sinyal yolağının bozulmasının çeşitli kanser tiplerinde sıkça gözlenmesi de AKT'ın tümör gelişminde önemli bir rolü olduğuna işaret etmektedir. AKT'ın C-RAF ile olan etkileşiminin MAPK yolağını aktifleştirdiği bilinmekle birlikte, MCF-7 hücrelerinde BAD fosforilasyonu sırasında oluşan komplekste, BAG-1 ile C-RAF'ın birlikte bulunduğu gösterilmiştir. Yine büyümeyi destekleyen bir yolak olan mTOR yolağının da AKT aracılığıyla aktifleştiğinin bilinmesi, bu çalışmanın da konusu olarak, BAG-1'in sağkalım öncesi etkilerinin AKT üzerinden mTOR yolağıyla sağlanıp sağlamadığı sorusunu akla getirmiş; mTORC1 yolağının rapamisin ile susturulduğu durumda, AKT ve BAG-1'in birbirini protein ifadesi derecesinde nasıl etkilediğinin anlaşılması hedeflenmiştir. PI3K-AKT-mTOR sinyal yolağının hücre içi ve hücre dışı sinyaller aracılığıyla hücre metabolizmasını, büyümeyi, proliferasyonu ve sağkalımı kontrol ettiği bilinmektedir. Bu yolağın aktivasyonunun çoğu tümör çeşidinin oluşmasına katkı sağlaması, PI3K, fosfainozitid-bağımlı kinaz 1 (PDK-1), AKT (Serin/treonin protein kinaz B), mTOR gibi bu yolakta yer alan elemanları kanser tedavisi için potansiyel hedefler olarak da sunmaktadır. Ölümsüzleştirilmiş memeli epitelyal MCF-10A hücre hattı, insan meme adenokarsinoma MCF-7 hücre hattı ve insan meme adenokarsinoma MDA-MB-231 hücre hattı bu çalışmada kullanılan hücreler olarak seçilmiştir. mTORC1 yolağı, 10 nM rapamisin ile başarıyla baskılanmıştır. Bu adımda, hücre canlılık testi için MTT analizi yapılmış, yolağın susup susmadığı fosfo-mTOR (Ser2448) ve mTORC1 yolağının altında bulunan fosfo-p70 S6K (Thr389) protein ifadelerindeki azalışla test edilmiştir. Western blot analizleri, zamana bağlı (1, 3 6, 9, 12, 24 saat) rapamisin uygulanıp total protein ekstratları kullanılarak yapılmıştır. mTORC1 yolağının susturulması, otofajiyi tetiklediğinden, belirlenen zaman aralıklarında hücrelerin otofajik aktivitesinin artıp artmadığı, Beclin-1 ve LC-3II/LC-3I otofajik belirteçlerin protein ekspresyon seviyelerindeki değişimin Western blot ile analiz edilmesiyle belirlenmiştir. LC-3II/LC-3I değişim oranı MCF-7 hücrelerinde dokuzuncu ve yirmi dördüncü saatte önemli ölçüde artarken, MDA-MB-231 hücrelerinde dokuzuncu saatte benzer artış saptanmıştır. MCF-10A hücrelerinde BAG-1 ifadesinin ilk saatte yaklaşık üç kat artış gösterdiği gözlenmiştir. MCF-7 hücrelerinde ise BAG-1 ifadesi üçüncü saatte kadar dereceli bir şekilde yaklaşık üç kat artış göstermiş, daha sonra deneyin son saatine kadar yine dereceli olarak azalarak kontrol örneğiyle benzer seviyeye ulaşmıştır. Bunun yanı sıra, MDA-MB-231 hücreleri yirmi dördüncü saate kadar dereceli olarak artış göstermiştir. MDA-MB-231 ve MCF-7 hücre hatlarındaki BAG-1 ifadesindeki zamana bağlı değişim, total C-RAF protein ifadesi ile neredeyse aynı oranda değişmiştir. Diğer yandan, total AKT protein seviyelerindeki değişim için, MCF-10A hücrelerinde birinci ve sonuncu saatlerde artış gözlenirken, MCF-7 hücrelerinde yirmi dördüncü saate kadar dereceli olarak azalma tespit edilmiştir. MDA-MB-231 hücrelerinde ise, total AKT seviyesi iki kat artış göstermiş olup, bu durum on ikinci saate kadar stabilitesini korumuştur. Bununla birlikte, fosfo-AKT (Ser473) protein ifadesindeki değişim incelendiğinde, MCF-10A hücreleride rapamisin uygulamasının ilk saatinde ani bir artış görülmüş, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde ise dokuzuncu saatte önemli derecede artış gözlenmiştir. Bu sonuçlar göz önünde bulundurulduğunda, BAG-1, AKT ve fosfo-AKT (Ser473) protein ifadelerinin MCF-10A, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre hatlarında zamana bağlı rapamisin uygulaması ile farklı şekillerde değiştiği ve AKT ile BAG-1 arasındaki etkileşimin hücrelerdeki otofajik aktiviteyle de ilgili olabileceği ortaya çıkarılmıştır.

Anti-apoptotic protein BAG-1 (BCL-2-associated athanogene) is usually found as overexpressed in several tumorous cancer tissues and plays crucial roles in cellular mechanisms. BAG-1 is a multifunctional protein that is involved in cell proliferation, cell motility, survival, apoptosis, transcription, differantiation and tumorigenesis through the interaction of various cellular proteins. In the nucleus, BAG-1 interacts with different kinds of nuclear hormone receptors and prevents apoptosis induced by hormones. However, in cytosol, BAG-1 is known to interact with heat shock proteins, BCL-2 (on inner cell membranes), and RAF-1 serine/threonine kinase while it also has ability to interact with cytosolic domain of growth factor receptors (like HGF, PDGF) on outer membrane, saving cells from cell death induced by growth factor receptors. There are three major isoforms of BAG-1 in human cells: BAG-1L, BAG-1M and BAG-1S. Differential expression of these isoforms when BAG-1 overexpressed can be used as stage-specific prognostic/predictive biomarker or in treatment of several malignancies. BAG-1 isoforms are found in different compartments in cell in different cellular stress conditions. In addition to this, a variety of interaction partners of BAG-1 in response to stress conditions make BAG-1 to be found in different functional complexes. Although it was demonstrated that BAG-1 prevents apoptotic activity by its direct interaction with BCL-2, the exact molecular mechanism of its anti-apoptotic function has not been fully clarified yet. In the previous studies of our group, Demir, S. studied BAG-1 in RAF-MEK-ERK signaling cascade. He found that protein expression levels of C-RAF, phospho-C-RAF (Ser388), B-RAF, ERK1/2, MEK1/2 and phospho-MEK1/2 (Ser221) that are involved in MAPK pathway were paralelly elevated with transient BAG-1 overexpression in MCF-7 cell line. Since the interaction between B-RAF and AKT was known to promote cell survival and protection against cell death, he also checked phospho-AKT (Ser473) protein expression which found to be increased with the expanded BAG-1 levels. Furthermore, when he investigated BAG-1 with co-immunoprecipitation and immunocytochemistry studies, he showed that BAG-1 was co-existed with B-RAF, phospho-AKT (Ser473), BCL-2, HSP70 and C-RAF which leads cell proliferation and survival by activating phosphorylation cascade in the beginning of MAPK pathway. When Demir indicated the possible relation between BAG-1 and AKT, he detected that pro-apoptotic protein, phospho-BAD (Ser136) level, which prevents cell death and induces cell survival, was also higher in BAG-1-overexpressed cells than that of wild type MCF-7 cells. Phosphorylation of BAD was known to be primarily provided by AKT, but also by B-RAF and C-RAF in neural cells and BAG-1 in a complex with AKT, B-RAF, BCL-2 and HSP-70 was demonstrated to cause phosphorylation of BAD at Ser136 residue and led cell survival in another study. In the light of the studies in literature and his results, it was suggested that BAG-1 was involved in the complex that is formed by C-RAF, B-RAF, HSP70, phospho-AKT and BCL-2 in order to phosphorylate BAD at Serine 136 for the prevention of apoptosis. Due to the fact that AKT was shown to be involved in the functioning of BAG-1 in cell survival, in the context of this thesis, BAG-1 protein was investigated in one of the major survival pathways, PI3K-AKT-mTOR pathway. In this study, the interplay between AKT and BAG-1 and survival effects of BAG-1 through AKT were aimed to be investigated through suppression of mTORC1 (Mammalian Target of Rapamycin Complex 1) in MCF-10A immortalized non-tumorigenic human breast epithelial cell line, MCF-7 human breast adenocarcinoma cell line, and MDA-MB-231 human adenocarcinoma cell line. mTORC1 pathway was successfully suppressed with 10 nM rapamycin, which was detected by dose-dependent MTT assays. Western blot analysis was done with total protein extracts from the cells that were treated by rapamycin in a time-dependent manner (1 hr, 3 hr, 6 hr, 9 hr, 12 hr, 24 hr). Suppression of the mTOR pathway was achieved in the first hour of rapamycin treatment and checked by the change in phospho-p70 S6K (Thr389) downstream target of the pathway and in phospho-mTOR (Ser2448) protein expression level. Since blocking of mTORC1 induces autophagy, we checked autophagic markers with the time-dependent rapamycin treatment. LC-3II/LC3-I conversion rate was significantly high within the nineth and twentyfourth hour of rapamycin treatment in MCF-7 and in the nineth hour in MDA-MB-231 cells. This result was also supported by the slightly increased Beclin-1 expression, which is an early autophagy marker. BAG-1 protein expression was upregulated almost three-fold in the first hour in MCF-10A. In addition, in MCF-7 cells BAG-1 gradually increased up to three-fold until three hours and gradually started to decrease around the level of control sample at the end of the twentyfourth hour whereas MDA-MB-231 cells showed gradually increased BAG-1 pattern until the end of the experiment. BAG-1 expression pattern of MCF-7 and MDA-MB-231 cells was similar to that of total CRAF expression pattern. On the other hand, total AKT protein expression level increased in the first and twenthfourth in MCF-10A and gradually decreased to the end of the rapamycin treatment in MCF-7 cells, whereas increased almost two-fold and stable up to twelfth hour when compared to that of control sample. However, phospho-AKT (Ser473) protein level immediately increased in the first hours of the treatment in MCF-10A cells and highly increased up to nineth hour in MCF-7 and MDA-MB-231 cells by rapamycin treatment. Together with these result, our studies suggested that BAG-1 showed different expression patterns with differential AKT and phospho-AKT (Ser473) expression levels between MCF-10A, MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines with the time-dependent rapamycin treatment. Also, the interplay between AKT and BAG-1 might be changed depending on the autophagic activity in the cells.