Farklı Organik Çözücülerin Yüzey Destekli Lipit Katmanlar Üzerine Etkilerinin Atomik Kuvvet Mikroskobu İle Araştırılması

Abstract

Biyolojik membranlar, canlı hücrelerin dış yüzeyini saran, seçici geçirgen, hücre içi ve dışı arasındaki iletişimi sağlayan özel bölgelere sahip membran sistemleridir. Biyomembranların bu karmaşık yapı ve görevlerinden dolayı kendi biyolojik ortamlarında incelenmesi oldukça zordur. Dolayısı ile, membran veya membran bileşenlerinin incelenebilmesi için bu yapıların izole edilmiş olması gerekmektedir. İzole edilen membran veya bileşenlerinin incelenebilmesi ve analizlerinin yapılabilmesi için bazı yüzeylere sabitlenmesi gerekebilmektedir. İşte bu noktada membranların incelenebilir olması için model membran sistemlerinin (yapay lipid membran) geliştirilmesine ihtiyaç duyulmuştur. Yapay lipid membran çalışmaları, biyolojik zarların yapısında yer alan moleküler olayları kavramak ve olası biyoteknolojik uygulamaları keşfetmek için büyük önem taşımaktadır. Yapay lipit membranlar benzersiz özellikleri nedeniyle, her geçen gün daha fazla ilgi çekmekte olup, temel ve uygulamalı araştırmalarda kullanılmaktadır. Yüzey destekli biyomimetik lipid katmanlar; biyolojik membranlar ve onları oluşturan lipid ve protein moleküllerinin temel özelliklerini araştırmak için önem arz eden model membran sistemleridir. Bu sistemler, yaygın olarak biyolojik membranların özelliklerinin incelenmesi, moleküllerin tanınması, enzimatik kataliz deneyleri, hücre yapışması ile ilgili işlemlerin özelliklerini araştırmak için bir model olarak kullanılır. Ayrıca son zamanlarda membran proteinlerini temel alan ilaç görüntüleme platformları oluşturma gibi çok sayıda pratik uygulamanın olabilirliğini de bizlere sunmaktadır. Atomik kuvvet mikroskobu (AKM), yüzey görüntüleme ve karakterizasyonu için geliştirilmiş çok önemli bir araçtır. AKM; hava, sıvı, vakum ortamı gibi çeşitli ortamlarda kullanılabilir. AKM yöntemi yalıtkan örneklerin özelliklerini bozmadan inceleyebilmeye olanak sağlayan yöntemlerden biridir. AKM ile örnekleri sıvı ortamda incelemek mümkündür. Sıvı ortamda kullanılabilmesinin biyolojik araştırmalar bakımından önemi oldukça fazladır. Çünkü bu yöntem, biyolojik yapıların kendi fizyolojik ortamlarındaki aktivitelerinin yüksek çözünürlükte incelenmesine olanak sağlayan tek yöntemdir. Son gelişmelerle birlikte yüksek kuvvet hassasiyeti ile yüksek hızda ortamı 3 boyutlu olarak analiz etmek AKM yöntemi ile mümkün olmaktadır. Ayrıca AKM yöntemi ile biyolojik moleküllerin dinamik yapı değişimini ve etkileşimlerini incelemekte mümkündür. AKM yönteminin bu özellikleri nedeniyle sıvı ortamda biyolojik yapıları inceleyen bilim insanlarını heyecanlandırmaktadır. AKM tekniklerinde, sivri bir iğne bulunur ve bu iğne ile yüzey taranarak yüzeye ait topografi ve çeşitli özellikler (iletkenlik, esneklik, 3 boyutlu görüntü vb.) elde edilir. AKM iğnesi yüzey üzerinde gezdirildiğinde örnek yüzeyi topoğrafisindeki değişiklikler, fotodedektör sensörde elde edilen sinyalin değişimine sebep olur. AKM tekniğinde yüzey ızgara (raster) tarama tekniği ile taranır. Yay ile yüzey arasındaki etkileşim kuvveti sabit tutulacak şekilde sensör dikey olarak hareket ettirilir ve bu hareket 2 boyutlu bir dizide tutularak her bir veriye karşılık renk değeri atandığında 3 boyutlu yüzey topoğrafi görüntüsü elde edilmiş olur Bu çalışmada tek çeşit lipit (fosfatidilkolin-PC) kullanılmıştır. Kullanılan lipidin geçiş sıcaklığı (Tc) -10ºC olup oda sıcaklığında (22-24ºC) sıvı fazdadır. PC lipid membranların oluşturulmasında, lipozom (100 nm) yapıları içeren tampon çözeltisi, ince lipit film/ekstrüzyon yöntemi ile üretildikten sonra mika yüzeyine transfer edilmiştir. Mika yüzeyine transfer edilen çözelti, yüzeyde yüzey destekli lipid katman (SLBs) yapılar oluşturmuş olup analizlerde kullanılmıştır. Bu çalışmada, mika yüzeyinde SLBs membranlar oluşturularak, bazı organik çözücülerin SLBs membranlar üzerine etkileri incelenmiştir. Mika yüzeyinde oluşturulan SLBs membranların tekrar organik çözücüler aracılığı ile çözünmesi esnasında ve sonrasında AKM tekniği ile yüzey 3 boyutlu olarak görüntülenmiştir. Deneylerde kullanılan organik çözücüler etil alkol (EtOH), izopropil alkol (IPA), kloroform ve asetondur (ACE). Bu organik çözücülerin, yapay lipid membranlar üzerine etkilerinin araştırılmasında her organik çözücü için farklı iki konsatrasyon (%10 ve %25) denenmiş olup deney sonuçları AKM ile görüntülenmiştir. Çalışmalara ilk olarak SLBs membrane oluşumunun görüntülenmesi ile başlanmıştır. Lipozom içeren fosfat tampon çözeltisi (PBS), temiz mika yüzeyine damlatıldıktan hemen sonra AKM mikroskobu ile mika yüzeyi taranmaya başlanmıştır. Tarama 128 dakika boyunca sürmüş olup her 8 dakikada bir götüntü alınmıştır. Ilk 48 dakika boyunca yüzeyde herhangi bir SLBs oluşumu gözlemlenmezken 64. dakika ile 88. dakika arasında taranan alanın hemen hemen tümünün SLBs ile kaplandığı görülmüştür. İlk 48 dakika boyunca mika yüzeyinde SLBs membran oluşmamasının iki farklı nedeninin olabileceği düşünülmektedir. Bunlardan biri, oluşturulan lipozomların PBS içerisinde askıda kaldığı ve zamanla mika yüzeyine inerek yüzeyde SLBs membran oluşturduğu fikri, diğeri ise tarama esnasında AKM iğnesi ve mika yüzeyindeki etkileşimden dolayı tarama alanında SLBs membran oluşum sürecinde AKM iğnesi ile tekrar süpürülerek yüzeyden atılması fikridir. 48. dakikadan sonraki zaman diliminde ise yüzeyde fazla miktarda lipozom yapısının parçalanması dolayısı ile SLBs membran oluşumu söz konusu olmuştur. Mika yüzeyinde SLBs membran oluşumu esnasında görüntüleme yapılmasının ardından organik çözücülerin (EtOH, IPA, kloroform ve ACE), SLBs membran çözünmesi üzerine etkileri ayrı ayrı araştırıldı. Bunun için her deneyde ilk olarak mika yüzeyinde SLBs membran oluşup oluşmadığı AKM ile görüntülendi. Yüzeyde SLBs membran oluşumunun görülmesinin ardından ortama her deney için ayrı konsatrasyonda organik çözücü (%10 ve %25) eklenerek yüzeyler tarandı. AFM ile mika yüzeyindeki lipidlerin analizi sırasında birçok problem ile karşılaşılmıştır. Bunların başında, fosfat tampon çözeltisi (PBS) içerisine eklenen organik çözücülerin tarama esnasında buharlaşması sonucunda, sıvı ortamın yoğunluğu sürekli değişerek lazer ışığında sapmalara/veya kaymalara neden olmuştur. Bu da alınan görüntülerin kalitelerini etkilemiştir. Bu çalışmada mika yüzeyinde oluşturulan SLBs membran yapıları bazı deneylerde hemen hemen tüm mika yüzeyini tamamen kaplarken bazı deneylerde ise adacıklar halinde mika yüzeyini kapladığı görülmüştür. Bu durumun nedeni araştırıldığında boş mika yüzeyindeki alt etki alanlarının veya delik/defektlerin olmasından dolayı adacıklar halinde SLBs membran yapıların oluştuğu görülmüştür. Organik çözücülerin SLBs membranları çözme mekanizmaları; fosfolipid molekülü temel yapısında bulunan su seven (hidrofilik) baş ve su sevmeyen (hidrofobik) hidrokarbon zinciri ana grupları arasına girerek, bu aradaki etkileşimi kesmesi sonucunda SLBs membranda yapısal bir bozukluğua neden olarak organik çözücü içerisinde çözünmesi şeklindedir. Sonuç olarak, bu çalışmada, lipozomların mika yüzeyinde SLBs oluşturması ve organik solventler ile çözünmesi adım adım görüntülenmiştir. Yapılan analizler sonucunda bazı organik solventlerin SLBs çözünmesi üzerine çok etkili olduğu görülmüştür. Yapılan bu çalışma neticesinde organik çözücülerin SBLs membran yapılar üzerinde etkili olduğu görülmüştür. Kloroformun PC çözünmesi üzerinde etkili bir çözücü olduğu bilinmesine rağmen bu çalışmada, kloroformun etkileri eklenen çözücünün ortamdan hemen buharlaşması veya PBS içerisinde çözünememesi nedeniyle kloroform-SLBs etkileşiminin olmamasından dolayı gözlenememiştir. Diğer üç organik çözücü (ETOH, IPA, ACE) incelendiğinde, her üç çözücününde SBLs çözünmesi üzerinde çözme etkisinin olduğu görülmüştür. Yapılan analizler sonucunda SLBs çözünmesi üzerine en etkili organik çözücü ACE olup en az etkiye sahip çözücünün ise EtOH olduğu gözlemlendi. Kloroform PC molekülünü çözen temel çözücülerden biri olmasına ragmen kloroformun etkileri ise gözlemlenemedi.

Biological membranes are selectively permeable systems which cover surfaces of living cells, and provide transfer of molecules between intracellular and extracellular regions. Due to their complex structure and their duties on the cell, it is really difficult to observe them in their biological environment. Therefore, those structures should be isolated from each other to observe each individual component of the membranes. Those isolated membranes and the components of these membranes should also be stabilized on an arbitrary surface to analyze them in detail. Model membrane systems (artificial lipid membranes) have been developed to increase their reviewability. Studies on artificial lipid membranes are vital topic for understanding intermolecular interactions and discovering possible biotechnological applications in future. Artificial lipid membranes are getting significant attention by researchers due to their uniqueness, and their usability in fundamental and applied research. Surface supported biomimetic lipid layers are very crucial systems which allow to investigate the fundamental functions of lipid and protein molecules. Those systems have been utilized for a model to investigate the molecular delivery, the results of enzymatic catalysis experiments, and the cell adhesion extensively. Nowadays, drug-screening platforms, which use membrane as a base, could be considered as possible practical application of those systems. Atomic force microscopy (AFM) is a powerful tool to characterize the surface within nanoscale. It can be used in different medium like in liquid, vacuum or air. As used in the liquid medium, it has grown into an important provider to physiological and biological cell research. A thin needle is incorporated into AFM systems and through that needle, the surface is scanned and its topography is attained. Understanding the mechanisms ruling the biomembrane’s resistance to solubilization by organic solvents are crucial in biochemical research. In this thesis, the AFM imaging used to visualize the actions of a model supported lipid bilayer in the presence of different organic solvents at two different concentrations. AFM provides a unique tool to monitor the nanostructure of supported lipid bilayer membrane (SLBs) in their physiological conditions. It can probe the real-time events, like dissolution process of lipid bilayers. The composition of SLBs on the mica surface and deformation /desintegration of SLBs by organic solvents were observed by AFM. Ethyl alcohol (EtOH), isopropyl alcohol (IPA), chloroform and acetone (ACE) were used in this study. In order to observe the effects of solvents on lipid membranes, each organic solvent was used at two different concentrations (10% and 25% v/v) and results were obtained by AFM. In this study, single type phospholipid, phosphatydylcholine (PC), was used. Constructed bilayer was in the liquid phase at room temperature and it was observed that sweeping out the movement of lipids within the membrane was possible by scanning probe (Cantilever). In order to compose the PC lipid membrane, liposomes were produced by thin lipid/extrusion approach, and then, they were transferred on the mica surface where the lipid bilayers were formed, and analyzed with AFM. During the analysis of mica surface by AFM, many challenges were faced. Firstly, due to the rapid evaporation of some organic solvents, such as chloroform, liquid volume and concentration of the medium changed, which led to the deviation and shift in laser position on the photodetector. Therefore, any effect of chloroform on bilayer desintagration could not be observed. This problem might occur due to the sudden evaporation of chloroform which leave PBS, a non-solvent of lipids, in the medium. In conclusion, in this study, the composition of supported lipid bilayer on mica surface and also its desintagration/dissolution by organic solvents were monitored, step by step. Conducted analysis during this research revealed that, while some of the organic solvents had more pronounced effects on dissolution of supported lipid bilayer, others had no significant effect.