Bacillus Subtilis’de Gntr Ailesine Ait Lutr Transkripsiyon Faktörünün Doğrudan Kontrolü Altındaki Genlerin Chıp Ve Emsa Yöntemleriyle Belirlenmesi

Abstract

LutR transkripsiyon faktörü GntR familyasının bir üyesi olup B. subtilis'te lutR geni tarafından kodlanan global düzenleyici bir proteindir. lutR geni ilk keşfedildiğinde "yvfI" olarak adlandırılmış fakat laktat kullanımında görevli olduğu belirlendiğinde "lutR" (Lactate utilisation gene) adıyla tekrar adlandırılmıştır. B. subtilis LutR proteini, E. coli FadR regulatör proteini ile homologdur. LutR protein dizisi, GntR süperfamilyasının FadR alt familyasındaki farklı türlere ait ortologlarıyla da önemli homolojiye sahiptir. Ayrıca FadR benzeri proteinler birçok metabolik yolun regülasyonunda rol alırlar. GntR familyası DNA'ya bağlanmak için Heliks-Turn-Heliks (HTH) motifi kullanan regulator proteinlerden oluşan bir HTH-tip protein süperfamilyasıdır. Farklı çalışmalardaki CDD analizlerinde, GntR familyasında oldukça yaygın olan "FadR C-terminal ligand bağlanma bölgesi"nin, LutR C-terminalinde de yer aldığı tespit edilmiştir (PFAM 07729). Buna ek olarak LutR N-terminalinde bulunan 44 amino asitlik bölge ile GntR wHTH domain arasında önemli bir benzerlik olduğu belirlenmiştir (PF00392). GntR familyasına ait üyeler N-terminalde HTH motifi içeren bir DNA bağlanma domaini (DBD) ve C-terminalinde bir efektör bağlanma veya oligomerizasyon (EBD) domaininden oluşurlar. Bu proteinler DNA'ya bağlanmak için kullandıkları heliks-turn-heliks (HTH) motifi ile karakterize edilirler. DNA-bağlanma domaininin dışındaki bölgeler çok farklılık gösterirken, küçük bir β-tabaka ile beraber 3-heliksli bir çekirdekten oluşan DNA-bağlanma bölgesi bütün GntR familyasında oldukça iyi korunmuştur. Bacillus genusu üyeleri arasında antibiyotik üreten ana suş B. subtilis'tir. Yaklaşık 30 kadar antibiyotik üreten B. subtilis'e ait antibiyotikler oldukça farklı antimikrobiyal aktivite göstermektedir. Bunlardan bazıları gram pozitif, bazıları gram negatif mikroorganizmalara etki ederken, bazıları daha geniş spektrumda etkilidir. B. subtilis genomunda yaklaşık 350 kb'lık bir bölge antibiyotikleri kodlayan genleri içermekte olup, toplam genomun %4-5'ini oluşturmaktadır. Yapısal olarak oldukça değişken olan B. subtilis antibiyotiklerinin en önemli özelliklerinden biri fonksiyonel açıdan sadece antimikrobiyal ajan olarak görev yapmayıp, ayrıca hücre morfolojisi ve fizyolojisinin düzenlenmesinde de etkili olmalarıdır. Basilisin [L-alanine-(2.3-epoxycyclohexanone-4)-L-alanine] non-ribozomal yolla sentezlenen dipeptit yapıda bir antibiyotiktir. B. subtilis'te basilisin biyosentezinden polisistronik bir operon olan bacABCDEF (eski adı ywfBCDEFG) ve monosistronik bir gen olan ywfH sorumludur. Basilisin, N-terminalde L-alanin ve C-terminalde non-proteinojenik L-antikapsin rezidülerinden oluşur. Antibiyotik etkisinin görülmesi için L-antikapsin rezidüsünün serbest kalması gerekir. Bu, ancak basilisin bir peptidaz tarafından proteoliz edildiğinde gerçekleşir. Basilisin bir peptidaza maruz kalmadan önce bir peptit permeaz tarafından sitosöle transfer edilir ve L-antikapsin burada bir peptidaz tarafından serbest bırakılır. Dipeptit antibiyotik basilisin biyosentezi; B. subtilis'de global düzenleyiciler olarak görev yapan ComA, SpoOA, AbrB, ScoC, ve CodY proteinlerinin kontrolü altındadır. Bu kompleks regülasyon ağına, GntR tip transkrisiyon faktörü LutR'ında katıldığı belirlenmiştir. Akabinde L-laktat kullanımından sorumlu lutABC (eski adı yvfV-yvfW-yvbY) operonunun da LutR'ın kontrolü altında olduğu bulunmuştur. Son olarak, grubumuz tarafından yürütülen çalışmalar neticesinde; LutR ın, L-laktak kullanımı ve basilisin biyosentezinin yanı sıra, karbonhidrat kullanımı ve transportu, nitrojen metabolizması, fosfat alımı, yağ asidi ve fosfolipit biyosentezi, protein sentezi ve translokasyonu, hücre duvarı metabolizması, enerji üretimi, mobil genetik element transferi, fajla ilgili genlerin indüksiyonu, sporilasyon, sporilasyonun gecikmesi ve kanibalizm ve biyofilm oluşumu gibi pek çok farklı fizyolojik ve metobolik süreçte görev yapan birbirinden bağımsız birden fazla geni/operonu kontrol eden pleiotropik bir global regülatör olduğu bulunmuştur. N-terminalinde helix-turn-helix motifi içeren diğer bir protein SinR'dır. SinR proteini B. subtilis'te geç üreme sürecinde kompetans ve motilite gelişimini aktive ederken sporilasyon ve ekzoproteaz üretimini inhibe ederek çift yönlü düzenleyici rol sergilemektedir. SinR, Spo0A gibi pleitropik bir düzenleyici anahtar gibi hareket eder ve adaptif cevapların gelişmesini sağlayarak gereksiz olan potansiyel diğer cevapları engeller. lutABC operonu, hem LutR hem de SinR proteininin kontrolü altındadır. LutR ve SinR proteinleri birlikte hareket ederek lutABC operonunu baskılamaktadırlar. Biyofilm olarak bilinen uzun hücre zincirlerini bir arada tutan ekstrasellüler matriksten sorumlu epsA-O ve yqxM-sipW-tasA operonlarına ait 18 genin de SinR tarafından baskılandığı bilinmektedir. Bu tez çalışmasının temel amacı LutR transkripsiyon faktörünün, B. subtilis genomunda, doğrudan bağlanarak düzenlediği genlerin belirlenmesidir. Bu amaçla E. coli pQE60::lutR suşunda heterolok olarak üretilen ve saflaştırılan LutR proteini ile B. subtilis PY79 suşuna ait kromozomal DNA kullanılarak, amacımıza göre modifiye ettiğimiz in vitro kromatin immünopresipitasyon (ChIP) yöntemi uygulanmıştır. Sonrasında, LutR proteininin, uygulanan modifiye-ChIP yöntemi ile yakalanan aday genlere doğrudan bağlandığını doğrulamak için EMSA yöntemi kullanılmıştır. In vitro olarak doğrulanan söz konusu etkileşimlerin, gen ifadesi üzerinde pozitif veya negatif yöndeki etkisini belirlemek amacıyla da, ayrıca RT-qPCR yönteminden yararlanılmıştır. ChIP yöntemi kullanılarak yapılan bu çalışmada LutR proteininin doğrudan kontrol ettiği genlerden yuxO (comB, comAB) geni belirlenmiştir. Bunlara ilaveten, Dr. Öykü İrigül-Sönmez'in doktora tez (2012) çalışması kapsamında lutR geninin aşırı ifade edildiği, PY79 (amyE::Pspac::lutR lutR::Tn10::spc) suşunda gerçekleştirilen mikroarray analizleri sonucunda, lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD ve yvnB genlerinin, LutR'ın direk kontrolü altında olabileceği belirlenmiştir. Bu bulguların kesinlik kazanması için bu tez kapsamında uygulanan EMSA analiz sonuçları, söz konusu lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD ve yvnB genlerinin, direk LutR proteini tarafından kontrol edildiğini göstermiştir. Bunlara ek olarak, grubumuz tarafından sürdürülen daha önceki farklı araştırmaların sonuçları, SinR global regülatör proteinininin, test ettiğimiz LutR'ın direk kontrolü altında bulunan tüm genlere bağlanma kapasitesinin bulunduğunu göstermiştir. Bu bilgi doğrultusunda tez kapsamında yapılan EMSA analizlerinde LutR ve SinR proteinleri birlikte kullanılarak, LutR ve SinR'ın birlikte düzenledikleri olası yeni genlerin aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda yapılan EMSA analizleri sonucunda; LutR ve SinR proteinlerinin yuxO, lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD ve yvnB gen transkripsiyon seviyelerini birlikte düzenledikleri belirlenmiştir. Son olarak, deneysel analizlere paralel bir şekilde, karşılaştırmalı in silico analizler ve karakterizasyon çalışmalarıyla LutR proteinine ait biyoinformatik verilerin elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla iki analiz yolu takip edilmiştir. İlk analiz yolunda, çeşitli biyoinformatik araçlar yardımıyla farklı türlere ait LutR proteinlerinin fizikokimyasal, yapısal ve filogenetik özellikleri incelenmiş ve LutR'ın türler arasındaki benzerlik ve farklılıkları ortaya çıkarılmıştır. İkinci analiz yolunda ise sadece B. subtilis 168 suşuna ait LutR proteininin, kristallografik analizleri tamamlanmış ve yapısı iyi bilinen GntR-HTH-tip transkripsiyon faktörleri FadR ve YvoA ile PyMOL programı yardımıyla yapısal olarak karşılaştırılması yapılmıştır. Ayrıca bu tez çalışmasında kullanılan ChIP yöntemi için oluşturulan prosedür, prokaryotik sistemlere yönelik olması ve antikor kullanılmaksızın uygulanması açısından metodolojik bir yenilik sunmaktadır.

DETERMİNATİON OF GENES UNDER THE DIRECT CONTROL OF GNTR-TYPE TRANSCRIPTIONAL FACTOR LUTR İN Bacillus subtilis PY79 BY ChIP AND EMSA METHODS