Bakteriyel Biyofilm Oluşumunu Engellemeye Yönelik Enzim Bazlı Kaplama Yöntemlerinin Geliştirilmesi

Abstract

Biyofilm, canlı yada cansız herhangi bir yüzeye tutunarak mikrobik kökenli polimerik yapıya gömülü kalan mikroorganizma topluluğu olarak tanımlanabilir. Biyofilm oluşumu mikroorganizmaların yaşam alanları içindeki bir yüzeye teması ile başlar ve salgıladıkları çeşitli ekstrasellüler biyopolimerler sayesinde metal, plastik, medikal implant, hücre dokusu gibi çok farklı yüzeylere bağlanabilirler. Doğada var olan biyofilm yapıları genellikle farklı birçok mikroorganizma türünün oluşturduğu, biyopolimerler ile çevrilmiş heterojen bir yapıdır ve bu yapı biyofilmi oluşturan mikroorganizmalara çevresel koşullardaki değişime adaptasyon kolaylığı, antimikrobiyal kimyasallara karşı dayanıklılık gibi çeşitli avantajlar sağlamaktadır. Aynı zamanda bu katman toksik kimyasalların ve antibiyotiklerin geçişini engelleyerek biyofilm yapısındaki mikroorganizmalara önemli avantajlar da kazandırmaktadır. Hücre katmanları arasında bulunan su kanalları ise biyofilmin gelişmesinde hayati öneme sahiptir. Mikroorganizmalar ihtiyaç duydukları besinlere bu su kanalları sayesinde erişirken, atıkların uzaklaştırılması da yine su kanalları sayesinde kolaylaştırılır ve mikroorganizmaların sinyal moleküller aracılığı ile iletişim kurabilmeleri için de kanal görevi üstlenirler. Biyofilm oluşumunun istenmeyen bölgelerde gerçekleşmesi insan sağlığını ve endüstriyel verimliliği olumsuz olarak yoğun bir şekilde etkilemektedir. Biyofilm kaynaklı insan sağlığı problemleri, içme suyu kalitesindeki düşüş ve enerji üretim verimliliği gibi birçok konuda biyofilm oluşumunun verdiği hasarların maliyeti milyar dolarları bulmaktadır. Biyofilm oluşumuna, dental yüzeyler, gıda endüstrisindeki üretim bandındaki kontaminasyonlar ve havalandırma sistemleri gibi birbirinden çok farklı sistemlerde sıklıkla karşılaşılmaktadır. Hem insan ve toplum sağlığı hem de ekonomik açıdan yaratmış olduğu zararlı etkileri nedeniyle, yüzey üzerinde mikrobiyal birikimi engelleyebilecek veya en azından büyümesini ve yayılmasını durdurabilecek yöntemlerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar son yıllarda yoğun olarak yürütülmektedir. Biyofilm sistemlerinin, tehlikeli atıkların işlenmesi ve değerlendirilmesi, endüstriyel atık sularının filtrelenmesi, yeraltı sularının kontaminasyondan arındırılması gibi kullanım alanlarının bulunması ile birlikte, endüstriyel ve biyomedikal uygulamalarda biyofilm oluşumunun, ürün kontaminasyonu, enerji kaybı ve medikal enfeksiyona sebep olmak gibi birçok negatif etkisi vardır. Mikroorganizmaları bertaraf etmek için kullanılan geleneksel antibiyotik ve dezenfektanlar sıklıkla biyofilm yapısı üzerinde yeterli etkinliğe sahip olamamaktadır. Biyofilm yapısını bertaraf etmek için bu kimyasalların yüksek dozda kullanımı, biyomedikal uygulamalarda engel teşkil etmekte, endüstriyel sistemlerde ise çevresel sorunlara yol açmaktadır. Literatürde farklı endüstriyel ve medikal alanlarda kullanılan malzemelerin, cihazların ve ekipmanın yüzeyleri üzerinde biyofilm oluşumunu önlemeye yönelik çalışmalara rastlanılmaktadır. Bu anlamda en yakın çalışma, kateter manşetlerinin hidrojel ile kaplanarak mikroorganizmaların üremesini engelleyecek şekilde fiziksel ve kimyasal özelliklerinin değiştirilmesine yöneliktir. Bu uygulama mikroorganizmaların yüzeye bağlanma kabiliyetini düşürmesine rağmen, hidrojelin yüzeye homojen bir şekilde tatbik edilmesi oldukça zor bir işlemdir. Bu alanda bir diğer çalışmada ise, antimikrobik etkinliği bilinen gümüş iyonları ile kateter manşetleri kaplanmış, fakat gümüş iyonlarının zamanla ortama difüze olması, kaplamanın antimikrobik etkinliğini kaybetmesine neden olmuştur. Kaplama malzemesi olarak antibiyotiklerin kullanılması ise mikroorganizmaların kullanılan antibiyotiğe karşı direnç kazanmasına ve uygulamanın etkinliğini kaybetmesine neden olmaktadır. Yüzey üzerinde biyofilm oluşumunu engellemek için kullanılan alternatif yaklaşımlardan bir tanesi de enzimlerin kullanılmasıdır. Biyofilm oluşumunu engellemek için kullanılan toksik kimyasallar ile kıyaslandığında enzimlerin önemli bir üstünlüğü, enzimlerin çevreye zarar vermemesidir. Farklı tür mikroorganizmalar belirli bir yüzeye bağlanmak için farklı polimerler kullanmalarına rağmen yapılan çalışmalarda ticari olarak satılan proteazların biyofilm oluşturan mikroorganizmaların yüzeye bağlanma olasılığını düşürdüğü tespit edilmiştir. Ayrıca lizozim ve Polietilen glikolün kovalent olarak yüzeye bağlandıklarında yüzeyin antibakteriyel ve antiadhezif özellikler gösterdiği tespit edilmiştir. Çalışmada kullanılan mikroorganizma literatürde biyofilm çalışmalarında sıkça kullanılan mikroorganizmalardandır. Medikal cihazlar da dahil olmak üzere biyotik ve abiyotik birçok farklı yüzeye bağlanabilen ve biyofilm oluşturduğu bilinen gram-negatif bir bakteri olan Pseudomonas aeruginosa fırsatçı bir insan patojenidir. Tez çalışmalarında, mikroorganizmaların endüstriyel ve tıbbi alanlarda sıkça kullanılan yüzeylere bağlanarak biyofilm oluşturmalarını engellemek hedeflenmiştir. Çalışmanın ilk ayağında mevcut kaplama yöntemleri göz önünde bulundurularak, çalışmanın amacına uygun bir kaplama stratejisi belirlenmiştir. Sol-gel yönteminin stabilitesi, oda şartları altında uygulunabilirliği, inert özellikte olması ve ayrıca yüzey üzerinde fonksiyonel grupların oluşmasını sağlayabiliyor olmasından dolayı kaplama aşamasında kullanılması uygun görülmüştür. Sol-gel kaplama sayesinde yüzeyde oluşan fonksiyonel amin grupları doğrudan enzim immobilizasyonu için kullanıldığı gibi alternatif bir yöntemin de geliştirilmesiyle yüzeyde oluşturulan fonksiyonel karboksil grupları da enzim immobilizasyonu için kullanılmıştır. Bu amaçla kullanılan poli-akrilik asit molekülleri yüzeye kovalent olarak bağlanmış ve bunu takiben enzim immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Uygulanan her iki kaplama tekniğinin de enzimlerin yüzeye aktif biçimde bağlanmasını mümkün kılması karşılaştırma açısından ekstra bir avantaj sağlamaktadır. Çalışmalar boyunca gerçekleştirilen tüm kaplama aşamaları Fourier Transform Infrared Spektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu yöntemleri kullanılarak karakterize edilmiştir. Sol-jel kaplanan yüzeyler üzerine kovalent olarak bağlanmış enzimlerin aktiviteleri, yapılan spektrofotometrik çalışmalarla test edilmiş ve anti-biyofilm etkinlikleri konfokal taramalı lazer mikroskobu aracılığıyla yerinde görüntülenmiştir. Çalışmalarda kullanılan yüzeyler ise medikal cihazların yapımında ve endüstriyel cihaz ve malzemelerin üretiminde sıklıkla kullanılan paslanmaz çelik yüzeylerdir. Bu yüzeylerin hiçbir muameleye maruz kalmadığı ilk hallerinden enzim kaplanmış son hallerine kadar tüm adımları karakterizasyon çalışmaları ile incelenmiştir.

DEVELOPMENT OF ENZYME-BASED COATING METHODS FOR THE PREVENTION OF BACTERIAL BIOFILM FORMATION