Nano-ölçek Metal Yüzeylerde Moleküler Tanıma Esaslı Kendiliğinden Montaj Olabilen Protein Tasarımı

Abstract

Son zamanlarda, tıp ve teknolojiye yönelik geniş bir uygulama alanında, doğadan esinlenerek geliştirilen yeni malzemeler yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Bu biyolojik malzemelerin çeşitli yapı ve işleve sahip olmalarında rol oynayan anahtar unsurlardan bir tanesi hiyerarşik organizasyondur. Bu organizasyonun çok karmaşık olması nedeniyle söz konusu işlevlerin bire bir aynısının üretilmesi bizim mühendislik yaklaşımlarımızla bile zordur. Moleküler-ölçek tanıma esasına dayalı biyolojik olarak kendiliğinden montaj olabilme ilkesi ise Doğa’nın tasarımındaki anahtardır. Bu mekanizma, biyolojik malzemelerde gördüğümüz kendiliğinden organizasyon ve kendiliğinden düzenlemeyi kolaylaştırmaktadır. Söz konusu mekanizmada rol alan en önemli etkileşim moleküllerinin ise çok yönlü olmalarından dolayı proteinler olduğu anlaşılmıştır. Proteinlerin kendiliğinden montaj olabilme yeteneği gelecekte Doğa’daki tasarımların bire bir benzerlerinin yapılmasında rol oynayabilir. Proteinlerin daha küçük yapıları olan peptidler de Doğa’daki gibi çok yönlülüğe sahip yeni malzemelerin üretilmesinde önemli bileşenlerdir. Son zamanlarda anorganik malzemelere özgün olan peptidler yeni biyo-yüzey fonksiyonlaştırıcı ajan olarak cazip hale gelmişlerdir. Yüzeyleri peptidlerle fonksiyonlaştırma, biyolojik moleküllerin malzeme yüzeyine tutunmasını artırabilmekte ve diğer farklı malzemeler ile de kaplanmasını sağlamaktadır. Peptidlerin bu denli modülerite olmaları onların aynı zamanda çok farklı işlevsel proteinlerle de birleştirilme imkanını sağlamaktadır. Bu çalışmada, güdümlü bir şekilde kendiliğinden organizasyonu gerçekleştirme yeteneğine sahip işlevsel protein ve enzimlerin, peptidlerle olan tasarımı ve rekombinant birleştirilmesine ilişkin detayları sunmaktayız. Bu tez kapsamında, ilk önce, altın yüzeylere biyolojik olarak kendiliğinden montajı başarabilecek MBP-AuBP1 hetero-işlevsel yapı üretebilmek amacıyla, AuBP1 peptidini genetik yollarla iki farklı bağlayıcı kullanarak maltoz bağlayan protein (MBP) ile birleştirdik. Yüzey plazmon rezonans (SPR), lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) gibi spektroskopik tekniklerle MBP-AuBP1 füzyon proteinin çeşitli altın yüzeylere bağlanma ve kendi kendine tutunma özelliklerini karakterize ederek kanıtladık. Burada AuBP1 peptidi moleküler seviyede anorganik-organik ara yüzeyini etkili bir şekilde kontrol ederek, MBP’nin altın yüzeye uygun bir konformasyonda organizasyonunu sağlamıştır. Dahası softlitografi ve kendiliğinden montaj tekniklerinin kombinasyonu ile AuBP1 peptidi, altın nanoparçacık dizilişlerin (array) üzerine yüksek moleküler yoğunlukta ve bir takım kolay ve tekrarlanabilir adımlardan sonra etkili bir motif oluşturarak proteinin montajını kontrol etmiştir. Bu model sistem spesifik AuBP1 aracılığıyla kat-kat montajlama (layer-by-layer assembly) yeteneğini göstermektedir. İkinci tasarımımızda, altın bağlayan ikinci peptidimiz (AuBP2) ile kırmızı flüoresan protein olan DsRed-monomeri genetik füzyon tekniğiyle birleştirerek yeni, çok fonksiyonlu denetleme molekülü geliştirdik. Biyolojik görüntüleme, ilaç salınımı ve hedefe yönelik tanı mekanizmalarında kullanılmak üzere kendi kendine montajlanan altyapı birimlerinin oluşturulması için AuBP2 özgün bir bağlayıcı malzeme olarak nedeniyle kullanıldı. Ayrıca, AuBP2 peptidi çeşitli nano yüzeylerde fonksiyonel biyo-prob olarak kullanılacak olan altının kullanıldığı malzemelerin tasarımında DsRed’in immobilize olabilmesi için kullanıldı. AuBP2 aracılığıyla çok daha fonksiyonel DsRed-monomer üretilerek hem biyolojik algılama uygulamaları hem de analitik uygulamaları gösterilmiştir. DsRed’in kırmızı fluoresan özelliğinden dolayı fluoresan enerji transfer (FRET) uygulamalarında çok tercih edilmektedir. Çünkü nano ve mikro yüzeylerde çok avantajlı ve güvenilir sonuçlar vermektedir. Bu nedenle bu çalışmamızda kırmızı flüoresan özellikli ve altın yüzeylere immobilize olabilen füzyon protein ürettik. Bununla birlikte DsRed füzyon proteininin bakır metaline bağlanma potansiyelini araştırdık. DsRed’in bakır iyonuna karşı olan bu ilgisi altın nanoparcacıklarla da incelenmiştir. DsRed-AuBP2 bakır iyonu ve altın nanoparcacıklarıyla flüoresan şiddeti azalmaktadır. Bu da bağlanma kinetiği hakkında bilgi vermektedir. Bakır iyonu ve altın nanoparcacıklarının teknolojik önemlerinden dolayı DsRedAuBP2’li biyosensor üretilmiştir. Bununla birlikte DsRed-AuBP2’nin nanofiber oluşumunda da yer alabileceğini gösterdik. Oluşturulan nanofiberler altın nanoparçacığı ve kırmızı flüoresan protein içermektedir. Burada DsRedAuBP2’nin görevi altın nanoparçacıklarının PEO (polietilenoksit) polimeriyle derinlemesine etkileşimini sağlayarak fiber oluşumunun organizasyonunu sağlamaktadır. Böylece çok yönlü ve iletken nanofiberler üretilmiştir. Son olarak altın bağlama aktivesi de olan bir füzyon enzim tasarladık. Format dehidrogenaz (FDH), AuBP2 peptidiyle birleştirildi. Buradaki amaçla elektro katalitik aktiviteyi ölçen devre tasarımında kullanılan bir biyoelektrot üretildi. FDH-AuBP2’nin altın yüzeye immobilize olmasıyla biyoelektrot oluşturuldu ve bu elektrotu enzimin redoks aktivitesinin ölçülebileceği bir elektrik devre tasarımında kullandık. Enzimin format substratını CO2’ e dönüştürmesi, tasarlanan elektrik devresinde gözlenmiştir. Geliştirilen çok fonksiyonlu biyomoleküler yapıların kendiliğinden organizasyonu gerçekleştirdiği ve işlevsel hiyerarşik hibrit birimlerin meydana geldiği kanıtlanmıştır. Ayrıca, anorganiklere bağlanan peptidler, enzimlerin yüzeylere oryantasyonunun kontrolünü yapmaktadır. Her bir peptid ve enzim sistemlerinin genetik birleştirmenin ardından kimerik işlevlerin performansını araştırmak için detaylı bir şekilde değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu tezde sunulan tüm bulgular ve sonuçlarla ürettiğimiz proteinleri kullanarak yeni nanoyapılı malzemelerin oluşturulabileceği gösterilmiştir. Tasarladığımız çok fonksiyonlu proteinler altın yüzeylere yüksek affinite ve seçicilikle bağlanabilmektedir. Bundan dolayı protein tabanlı mikro/nano diziler, biyosensörler, biyopiller ve moleküler görüntüleme ve tanımlama sistemlerinde kullanılmıştır. Anorganiklere özgün bağlanan peptidlerin umut verici olan altyapı teknolojisi ve nano yapılı sistemlerdeki rolleri gösterildi. Bu amaçla metallere özgü flüoresan biyosensor, biyolojik pil üretimi için biyolojik elektrot ve iletken nanomat için nanofiber gibi nanoyapılar ürettik. Nano cihazların söz konusu peptid ve proteinlerden tasarlanması gelecekteki yöntemlere umut vadetmesine rağmen hala bir takım araştırılması gereken önemli hususlar vardır. Bu konu üzerinde sınırlı çalışmaların yayınlandığını gördük ve bu amaca yönelik rekombinant olarak, oldukça yüksek oranda üretilebilen, yeni protein yapıların (constructs) tasarlanmasına ilişkin sağlam bir strateji geliştirdik. Dahası, biyoaktif nanoyapılar oluşturmak için protein bileşiklerini kullanarak biyo-nanoteknolojik uygulamalara yönelik bir yaklaşım ileri sürdük. Bu yaklaşım yeni nano cihaz üretimi için anorganiklere özgün bağlanan peptidlerin proteinlerle birleştirilmesidir. Bu üretim sürecinde kendi kendine tutunma tekniğini kullanan ve altına özgün bağlanan (AuBP1 ve AuBP2) peptidleri kullandık. Daha önceki çalışmalarımızda gösterdik ki bu peptidler altın yüzeylere oldukça yüksek bir affinite ve seçicilikle bağlanmaktadır. Sonuçta, bu tez kapsamında geliştirilen proteinlerle yeni nano yapılı malzemelerin tasarlanabildiğini bu çalışmada yer alan bulgular göstermektedir. Geliştirdiğimiz çok işlevli proteinler uygun koşullar altında, nano ölçekten mikro ölçeğe kadar çeşitli altın yüzeylere karşı yüksek bir bağlanma ilgisine ve özgünlüğüne sahiptir. Bu yeni platformlar pek çok amaç için kullanılabilir. Örneğin, protein mikro/nano dizilişler, biyosensörler, biyobateriler ve moleküler görüntüleme ve hedefleme amacıyla kullanılacak belirteçler hazırlanabilir. Belirlediğimiz bu model, organizasyon, kaplama ve mimariyi kontrol edebilen çeşitli protein dizilişleri, plazmon-aktif nanometalik montajlar ve cihazların üretilmesinde tamamen biyolojik bir yol izlemektedir.

MOLECULAR RECOGNITION BASED SELF ASSEMBLY OF ENGINEERED PROTEINS ON NANOSCALED GOLD SURFACES